功能性饲料添加剂对克氏原螯虾非特异性免疫力及抗氧化能力的影响

万金娟，薛晖，唐建清*，黄鸿兵，孟祥龙，田立立，孙敏，陈风蔚

（1.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；2.扬州大学，江苏 扬州 225009）

克氏原螯虾（）俗称小龙虾，隶属甲壳纲（Cmstacea），十足目（Decapoda），螯虾科（Cambaridae），因其营养丰富、肉质鲜美以及特殊的饮食文化而受到消费者青睐。近年来，克氏原螯虾的养殖规模逐年扩大，据统计，2019年我国克氏原螯虾养殖总产量达208.96万t，养殖总面积达128.6万hm，与2018年相比分别增长27.52%和14.80%；其产量占淡水虾养殖总产量的50%以上，成为我国目前重要的经济水产养殖对象。随着人工养殖规模的扩大，其病害问题也逐渐凸显，给克氏原螯虾产业带来巨大损失。因此，如何提高克氏原螯虾自身免疫力和健康状况是产业迫切需要解决的问题之一。

随着滥用抗生素造成的危害日渐为人们所知，在养殖过程中使用适当的功能性饲料添加剂，以提高水产动物的免疫能力，增强其抗病性成为当下研究的重点。其中，中草药饲料添加剂已被报道在提高水产动物免疫力上发挥着重要作用。穿心莲、大青叶、大黄、辣蓼等是中国传统中药材，具有激活机体免疫因子、调节免疫系统、抗氧化、抗病毒等功效；牛磺酸同样被证实具有促进水产动物生长、增强机体免疫和抗急性胁迫的能力。但有关饲料中添加中草药和牛磺酸的复合添加剂对克氏原螯虾的影响尚未见报道。现通过功能性饲料添加剂对克氏原螯虾非特异性免疫力和抗氧化能力的影响的试验，以期为克氏原螯虾功能性饲料的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以鱼粉、花生粕、豆粕等为蛋白源，豆油、大豆磷脂油为脂肪源，配制基础日粮，饲料配方及营养成分分析见表1和表2。同时，在基础日粮中添加2%功能性饲料添加剂（项目组研制，其主要成分为穿心莲、大青叶、大黄、辣蓼、牛磺酸等），制成功能性饲料。试验饲料按照克氏原螯虾商品料由江苏海普瑞饲料有限公司加工制作。

表1 饲料组成① %

表2 饲料营养水平（风干基础） %

1.2 试验虾与饲养管理

克氏原螯虾由江苏现代农业（克氏原螯虾）产业技术体系基地提供。试验池塘位于江苏省淡水水产研究所扬中基地。虾运至基地后，先在水泥池中暂养、驯化7 d，随后挑选附肢完整、体格健壮、规格基本一致的幼虾[初均体质量（9.84±1.17）g]，随机分为2组（对照组D1，投喂普通商品料；试验组D2，投喂功能性饲料），放入养殖池塘中。为保证2组养殖试验条件的一致性，将1 334 m的塘从中间用防逃网隔成两个667 m的试验小塘口（栽种等量的水草）。每个试验塘各投入15 kg幼虾。试验期间，每天19：00定量投喂1次，初始投饲量为虾总体质量的4%，随后日投饲量根据虾的吃食情况进行调整，保证不过剩；减少人为干扰，每日观察虾的摄食及死亡情况，并及时将死虾捞出，查明死亡原因，做好记录；实时监测水质情况。

1.3 采样与处理

在正式投喂前（0 d）以及投喂后10，20，30，40 d分别采样，每次采样前禁食24 h。采样时，从每个试验塘随机选取体质量基本一致的雌、雄虾各3尾，运至实验室后，用1 mL的一次性注射器从每尾虾的头胸甲后部刺入心脏，抽取0.5 mL血淋巴，放入装有等量抗凝剂（140 mmol/L NaCl，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L柠檬酸三钠，26 mmol/L柠檬酸，10 mmol/L NaDTA，pH值4.6）的1.5 mL离心管内，4℃静置4 h，然后10 000 r/min离心10 min，取上清液，用于部分生理生化指标测定。随后解剖，取出肝胰腺，置于-20℃冰箱中保存，用于检测抗氧化指标。

1.4 指标测定

1.4.1 血淋巴生化指标的测定

选取溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）活性作为非特异性免疫指标。LZM、ALP、ACP的活性采用相应试剂盒方法测定，试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.4.2 肝胰腺抗氧化指标的测定

选取超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）作为抗氧化指标。SOD、CAT活性及MDA含量采用相应试剂盒方法测定，试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.5 数据统计与分析

同一采样时间不同组之间的试验数据用SPSS 23.0统计软件中独立样本检验（Independent samples-test）进行差异显著性分析；同一组不同采样时间之间的试验数据用SPSS23.0统计软件中One-way ANOVA程序进行方差分析，并采用Duncan氏多重比较法进行差异统计学意义检验，结果均以“平均值±标准差”表示，当＜0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影响见图1。由图1可知，随着投喂时间的增加，2组虾血淋巴溶菌酶活力呈先降低后升高的变化趋势。在投喂前及投喂后第10、20天时，2组间溶菌酶的活力差异不具有统计学意义（＞0.05）；投喂后第30、40天时，功能性饲料组虾的溶菌酶活力均显著高于对照组（＜0.05）。

图1 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴溶菌酶（LZM）活性的影响

2.2 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴碱性磷酸酶（ALP）活性的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴碱性磷酸酶（ALP）活性的影响见图2。由图2可知，随着投喂时间的增加，2组虾血淋巴碱性磷酸酶的活性呈先升高后降低的趋势。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）时，两组间碱性磷酸酶的活性差异不具有统计学意义（＞0.05）；投喂后第10、20天时，功能性饲料组虾的碱性磷酸酶活力均显著高于对照组（＜0.05）。

图2 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴碱性磷酸酶（ALP）活性的影响

2.3 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影响见图3。由图3可知，随着投喂时间的增加，两组虾血淋巴酸性磷酸酶活性的变化同碱性磷酸酶一致，均呈先升高后降低的趋势。在投喂前以及投喂后期（30、40 d）时，2组间酸性磷酸酶的活性差异不具有统计学意义（＞0.05）；投喂后第10、20天时，功能性饲料组虾的酸性磷酸酶活力均显著高于对照组（＜0.05）。

图3 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾血淋巴酸性磷酸酶（ACP）活性的影响

2.4 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响见图4。由图4可知，随着投喂时间的增加，两组虾肝胰腺超氧化物歧化酶活性呈略有降低的趋势。在投喂前、后，两组间超氧化物歧化酶的活性均差异不具有统计学意义（＞0.05）。

图4 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

2.5 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺过氧化氢酶（CAT）活性的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺过氧化氢酶（CAT）活性的影响见图5。由图5可知，随着投喂时间的增加，两组虾肝胰腺过氧化氢酶的活性呈逐渐降低的趋势。在投喂前、后，两组间过氧化氢酶的活性均差异不具有统计学意义（＞0.05）。

图5 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺过氧化氢酶（CAT）活性的影响

2.6 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影响

功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影响见图6。由图6可知，随着投喂时间的增加，两组虾肝胰腺丙二醛的含量呈先升高后降低的趋势。在投喂前及投喂后第10、40天时，两组间丙二醛的含量差异不具有统计学意义（＞0.05）；投喂后第20、30天时，功能性饲料组虾的丙二醛含量均显著低于对照组（＜0.05）。

图6 功能性饲料添加剂对克氏原螯虾肝胰腺丙二醛（MDA）含量的影响

3 讨论

已有研究结果表明，功能性饲料添加剂对水产动物具有促生长、提高免疫力、抗氧化和抗应激的能力。

血清LZM在甲壳动物机体内能破坏革兰阳性菌细胞壁中的肽聚糖层，从而使机体抵御病原微生物的入侵。ALP和ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，在甲壳动物免疫体系中是衡量机体免疫机能和健康状况的重要标志。在该试验中，功能性饲料组克氏原螯虾血清LZM的活性在投喂后第30、40天，ALP和ACP的活性在投喂后10、20 d时显著高于对照组，表明在基础商品料中添加功能性饲料添加剂能提高虾体LZM、ALP和ACP的活性，从而提高机体的免疫力。陈孝煊等用分别含1%的大黄、穿心莲、板蓝根和金银花水提取物的饵料连续28 d饲喂异育银鲫，结果显示，投喂后第4、7天时，血清溶菌酶的活性显著高于对照组；符云等报道，在饲料中添加一定量的复方中草药制剂（主要成分为黄芪、金银花、杜仲等），可以显著提高凡纳滨对虾血清中的LZM、NOS、ALP和SOD等活性；崔青曼等在报道中指出，复方饲料添加剂（主要成分为海藻多糖、大黄、黄芪、连翘等）能显著提高河蟹机体的免疫功能，与该研究结果一致。

正常状态下，动物机体的抗氧化系统本身具有清除氧自由基的能力，抗氧化酶主要包括SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等；MDA是脂质过氧化的反应产物，其在机体中的积累程度可以反映机体过氧化受损状况。有研究表明，复方中草药（大黄、黄芪、连翘、黄芩和丹皮）、穿心莲、牛磺酸能提高白点鲑、半滑舌鳎、虹鳟等水产动物的肝脏抗氧化能力。在该试验中，功能性饲料添加剂的添加虽未显著影响虾肝胰腺SOD和CAT的活性，但虾的肝胰腺MDA含量在投喂后第20、30天时显著降低。表明中草药和牛磺酸复方添加剂在一定程度上提高了克氏原螯虾的抗氧化功能。这是因为，穿心莲、大黄等中草药的有效成分——穿心莲内酯、大黄素等，可以抑制自由基生成，防止脂质过氧化，从而降低自由基毒性，起到抗氧化的作用；牛磺酸可能是因为其具有稳定细胞膜脂质成分的能力，其具体作用机制还需进一步深入研究。