应激颗粒在细胞衰老中的作用

金志刚， 蒋莹佩， 张晶晶

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

1 细胞衰老及其调控机制

1.1 衰老表型特征

细胞衰老(cellular senescence)是当不断增殖的细胞受到氧化应激、DNA损伤和癌基因活化等内源或外源压力时诱发的细胞周期永久停滞的一种状态[1].对细胞衰老的首次描述可以追溯到20世纪60年代，Hayflick等[2]观察到在体外培养条件下，人类二倍体成纤维细胞增殖至一定代数后达到极限并停止增殖，这种极限被称为“Hayflick极限”.细胞衰老会诱发永久的细胞周期停滞，并引发细胞表型变化，如生物活性分泌物的产生，称为衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[3].机体在发育过程中通过衰老细胞诱导组织重塑、伤口愈合和肿瘤抑制反应[4-5]，这些衰老细胞通过SASP的产生来招募免疫细胞，诱发机体免疫反应，从而清除衰老细胞[6-13].但随着年龄的增长，机体免疫机能逐渐衰退，此时衰老细胞分泌的SASP则发挥免疫抑制功能[14-15]，引发系统性炎症甚至破坏组织内稳态[16-19]，成为许多衰老相关疾病的诱因.因此，通过选择性清除衰老细胞来延缓衰老和限制衰老引起功能障碍的方法，即衰老细胞清除疗法(senotherapy)，目前受到广泛关注[3,19-20].

具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原激活物抑制子-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是参与SASP的一种重要分泌蛋白，最早在1991年发现，过早衰老的细胞中PAI-1表达升高[21]，此后陆续在其他组织发现其与衰老细胞紧密联系，被认为是衰老标志物之一[3,22-23].靶向PAI-1的小分子抑制剂TM5441可以有效防止阿霉素诱导的心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的衰老[24-26]，从而改善小鼠的血管衰老及细胞衰老引起的损伤[27-28].除此之外，衰老表型特征还包括但不限于衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)增加，p16INK4A、p53和p21等细胞周期抑制因子表达水平增高，γ-H2AX等的DNA损伤，衰老相关异染色质灶(senescence-associated heterochromatin foci,SAHF)等，这些衰老表型特征不仅可作为评估各种衰老模型的衰老进程标志物[29]，还可作为衰老细胞清除疗法的药物靶点[30-33].

1.2 调控细胞衰老的信号通路

过去30年对细胞衰老的研究已经从衰老表型转向这些表型背后的分子机制.目前通过遗传分析发现，调控细胞衰老的信号通路主要涉及营养摄取和蛋白质稳态等方面(见图1).

红色表示促进细胞衰老;绿色表示维持正常细胞，抑制细胞衰老

IIS通路、mTOR通路、AMPK、FOXO和sirtuins是调控细胞衰老的主要途径，通过调节细胞营养感知、能量代谢和蛋白稳态来拮抗调控细胞衰老，且在酵母、线虫、苍蝇和哺乳动物中是相对保守的[3,34-35]，以下作简要概述：1)从营养感知来说，机体衰老与胰岛素/IGF-1信号通路(insulin/IGF-1signaling,IIS)有关.营养匮乏时，IIS通路被阻断，导致叉头盒蛋白O(the fork head box protein O,FOXO)线虫同源蛋白DAF-16活化，进而激活了下游抗衰老靶基因的转录[35-38]，表明降低IIS通路活性可以延长线虫寿命.除此之外，IIS通路还会引起葡萄糖运输和脂肪代谢受损，而抗衰老因子则通过降低细胞对IGF-1的利用、激活腺苷单磷酸激活激酶(AMP-activated kinase,AMPK)、阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路、增加自噬活性和维持线粒体完整性来促进机体长寿[35].2)mTOR通路，感知营养的另一个重要途径，可以调节细胞生长，整合胰岛素信号和细胞应激信号，从而调节mRNA翻译、自噬、转录和线粒体功能等过程[35,38].激活mTOR复合物1(target of rapamycin complex1,TORC1)会加速细胞和组织衰老的过程，而通过雷帕霉素、TORC1基因失活或饮食限制(dietary restriction,DR)来抑制mTOR通路，可以延长模式生物寿命并改善一系列生理表现[39].3)AMPK是细胞内重要的能量感受器和调节器，可以感知细胞压力、运动、多种激素及影响细胞代谢的物质等各种刺激.AMPK在细胞能量水平低时被激活，并通过抑制TORC1阻断蛋白质合成，通过促进线粒体呼吸维持细胞能量[35,40]，从而延缓细胞衰老.4)NAD+是三羧酸循环和电子呼吸链上重要的辅酶，NAD+依赖性蛋白去乙酰化酶sirtuins家族蛋白是重要的衰老调节因子家族.早在对酵母菌、果蝇和线虫的研究中发现，sirtuins家族显著延长了这些模式生物的寿命[41-42].sirtuins家族的7个成员(SIRT1-7)，通过调控p53，AMPK等信号通路[43-44]，来调节线粒体稳态、基因组稳定性、NF-κB信号传导和葡萄糖代谢，参与DR介导延长细胞寿命[41,45-46].综上，IIS通路、mTOR通路、AMPK和sirtuins通过对营养或能量的感知和调节，在细胞衰老过程中发挥了重要作用.

1.3 衰老细胞的蛋白质稳态失衡

蛋白质稳态失衡既是细胞衰老的重要特征，也是诱发机体衰老的主要原因[47-48].细胞蛋白质稳态的维持需要精确控制蛋白质合成、折叠、构象维持和降解等过程，这些过程需要不同类别的分子伴侣及其相关调节因子，以及蛋白酶体或溶酶体共同协调，同时还需要ATP供能，来减少蛋白错误折叠或聚集[49-51].随着年龄的增长，热休克蛋白HSP70(heat-shock protein 70)[52-53]和热休克转录因子HSF-1(heat shock transcription factor-1)[54]等分子伴侣活性下降，蛋白酶体功能减弱，导致包括内质网的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)在内的蛋白质量控制系统(protein quality-control system,PQC)严重受损，PQC受损导致的蛋白质聚集是衰老细胞及衰老相关疾病的重要标志[48-49,51,55-57].在许多模型中，通过外源性表达单个分子伴侣或通过药理学诱导应激反应上调多个分子伴侣，已被证明可以防止毒性聚集体的形成或诱导形成毒性较小的聚集体[49,58-59].这种PQC成分的上调允许细胞清除急性压力诱导的错误折叠蛋白质及其聚集体，但无法清除与神经退行性疾病相关的淀粉样蛋白质聚集体，如β-淀粉样蛋白、Tau、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)和TDP-43等神经毒性蛋白质聚集体[49,60].衰老神经元内蛋白酶体和HSP70活性下降，会促进TDP-43液滴形成，当ATP水平降低时，TDP-43液滴进而向固态聚集体转变[61].这些蛋白质聚集体可以通过衰老细胞清除疗法来清除，从而延缓衰老相关疾病的表型[62-63].这些证据都表明，蛋白质稳态失衡对细胞衰老影响甚大，因此，阐明细胞衰老过程中的蛋白质稳态失衡可为抵抗衰老及治疗衰老相关疾病提供重要依据.

2 应激颗粒简介

如前所述，IIS通路、mTOR通路、AMPK和sirtuins作为营养或能量的感知器和调节器，在细胞衰老过程中发挥了重要作用.近年研究发现，应激颗粒(stress granules,SGs)作为压力的感受器和调节器，也参与调控了细胞衰老.真核细胞在面对热刺激、病毒感染、高渗透压、氧化应激及紫外辐射等不利环境条件时有一种典型的应激反应，包括抑制整体翻译及选择性上调分子伴侣[64-65].处于翻译暂停状态的多聚体核糖体解离，导致细胞质中无核糖体结合的游离mRNA浓度升高，并与一些RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)结合，最终形成了细胞质凝聚体，即SGs.SGs主要由mRNA-蛋白复合物组成，其蛋白组分包括多种翻译起始因子、RBPs和非RBPs[65-66].

SGs是动态复杂可变的生物分子凝聚体，其组成和结构在不同类型的压力下会发生巨大变化，这种多样性被认为是依赖于SGs内部蛋白质和RNA之间的不同相互作用，并反映了细胞对各种环境压力快速响应的能力[65,67].因此，SGs的动态过程及其调控，对于细胞应对应激压力就显得至关重要.

SGs是无膜细胞器，具有成分、功能和动力学各不相同的2层结构，即由松散相互作用的分子形成的外壳及SGs核心与mRNA紧密结合构成的内核[64-65,68].由多价弱大分子相互作用(蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA和RNA-RNA相互作用)驱动的液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)是无膜细胞器自组装的一个重要条件[65,69].LLPS是将混合溶液中的成分分离成2种不同相的过程，某些成分在一个相中富集，在另一个相中减少[70]，使得这2个相中的成分可以很容易地重新排列，并可以快速地相互交换物质.这也是SGs这类无膜细胞器既能够与胞浆保持分离，又能对环境压力作出快速反应的原因之一[69].高浓度的大分子必须达到临界阈值才能启动LLPS，但是超过一定的浓度，SGs内部的大分子如蛋白质，更倾向于形成聚集体.这可能导致LLPS产生的液体组分具有凝胶状或固体状的特性，从而使得液体组分无法正常工作，如病理性的胞质或核蛋白质聚集体[66,69,71].

SGs的一个重要功能是使细胞能够适应不同的环境变化.在压力条件下，SGs为细胞的关键组分提供了暂存场所，如暂停翻译的mRNA和暂停信号传递的信号转导分子，从而为适应或消除压力后mRNA返回多聚核糖体重启翻译、信号转导分子返回胞浆重启信号转导等正常生理活动的恢复奠定了基础.通过压力诱导的SGs组装来招募信号分子，通过压力消除后的SGs解聚来释放信号分子，SGs因而也成了细胞应激反应的信号转导中心.比如SGs与mTOR信号通路存在互相调控.压力刺激后，TORC1定位至SGs被隔离，信号终止；而在压力消除后，TORC1随着SGs解聚被释放并重新激活信号[72]；TORC1则通过磷酸化4E-BP1(4E-binding protein 1)驱动eIF4E介导的SGs形成[73].此外在亚砷酸盐(arsenite,AS)诱导下，TORC1组分定位在SGs中从而抑制氧化应激诱导的细胞凋亡[74].研究表明，SGs通过招募促凋亡信号分子RACK1(the receptor for activated C kinase)抑制细胞凋亡[75-76].

综上，在整个应激过程中，SGs通过在压力条件下临时储存mRNA和信号分子，暂停了mRNA翻译和信号转导，并允许压力消除后随着SGs解聚快速重启翻译和信号转导.因此，SGs在应激反应中发挥了重要功能，而SGs的异常也导致了mRNA和蛋白质等在内的生物大分子的功能紊乱，并与多种衰老人群易感疾病相关，包括神经退行性疾病和肿瘤等.目前越来越多的研究表明，SGs与细胞衰老存在着密切关联(见图2).

3 应激颗粒对细胞衰老的调控

3.1 应激颗粒调控衰老相关信号通路

当细胞受到外界刺激时，会快速响应应激反应，而SGs作为信号转导中心，通过招募支架蛋白、转录翻译相关蛋白质、信号通路中各种相关激酶及重要成员，从而调控细胞适应环境变化.当细胞无法承受外界刺激时，会启动细胞衰老、退出细胞周期，限制旧细胞或受损细胞的复制，从而保证周围正常细胞的存活.同样，细胞衰老也是对细胞应激的一种响应，目前已有许多证据表明，SGs与细胞衰老密切相关，二者相互影响和调控(见图2).

图2 SGs与细胞衰老相互调控

SGs通过招募衰老相关因子调控细胞衰老.1)PAI-1是一种衰老激活因子，正常条件下以分泌蛋白的形式分布于细胞外基质.当细胞受到AS刺激后，PAI-1被招募至SGs，SGs抑制了PAI-1的促衰老功能，从而促进了细胞周期蛋白D1(cyclin D1)入核及Rb磷酸化，使得细胞维持增殖、非衰老状态[77].另外，CO诱导的SGs可以通过隔离PAI-1抑制博来霉素诱导的细胞衰老，而同时加入SGs抑制剂ISRIB处理后，SGs组装被抑制，使得博来霉素诱导的细胞衰老被重启，这提示SGs可以通过招募衰老关键因子致其功能失活，从而对抗细胞衰老[78].2)TORC1被过度激活能促进细胞衰老，而在应激条件下，TORC1被隔离在SGs，使得mTOR信号终止，延缓细胞衰老.当压力消退后随着SGs解聚，TOPC1被释放，才重新激活mTOR信号[72].除此之外，线粒体功能及生物发生、基因组稳态[35,79-81]等方面的证据提示，SGs在细胞响应外界刺激时形成的RNA和蛋白网络，同样也可能是细胞无法响应外界刺激时进入衰老过程的信号转导中心.

综上，SGs作为细胞应激反应的临时信号转导中心，赋予细胞应激反应能力，并通过招募衰老相关调控因子，发挥延缓细胞衰老的作用.

3.2 异常应激颗粒对衰老相关疾病的影响

正常情况下，SGs的产生是为了保护细胞不受急性应激的损害，即使有异常的SGs产生也会在PQC的调控下被靶向蛋白酶体或溶酶体清除，但在病理条件下，异常SGs会是某些疾病的病灶.SGs的形成和细胞衰老这两个过程有许多相似的特点，尤其是蛋白质稳态变化，因此，病理条件下SGs也可能是衰老相关疾病的病灶.目前发现，细胞年龄相关性蛋白在各种组织中出现多种生理和病理蛋白质聚集体，尤其在神经退行性疾病中发现多种蛋白质在衰老过程中极易形成聚集体[79].

已经有证据显示，SG蛋白PAB-1和TIAR-2均能在衰老的线虫中形成聚集体，这表明SGs蛋白质聚集体可能加速衰老，减少寿命[82-83].另外，SGs所包含的RBPs大多含有内在无序区，使得这些蛋白构象灵活、易于折叠且倾向于自发转变为不溶性的聚集体，这种特性使得与之互作的其他蛋白和RNA也倾向于聚集，从而形成不可逆的聚集体，尤其当这些RBPs在特定区域发生突变时，更容易形成聚集体.这些异常的、不可逆的聚集体在去除应激后会导致SGs持续性存在，进而引起细胞内的其他病理变化，这其中就可能涉及某些衰老调控因子[65-66,69-71].

此外，一些包括TDP-43，FUS和Ataxin-2在内的胞质淀粉样蛋白质聚集体能通过隔离核质转运体来干扰核完整性和核质运输，这些影响可能加速衰老和神经退行性疾病的发病[84-88].而这些胞质淀粉样蛋白质聚集体也被报道与SGs有密切联系[66,85]，因此，阐明SGs的动态过程及异常发生，对衰老相关疾病的研究及治疗有重要意义.

4 细胞衰老对应激颗粒的动态调控

4.1 细胞衰老参与应激颗粒动态过程调控

细胞衰老本意是保护细胞以免获得不必要的损害，但随着衰老进程的继续，基因组稳态失衡、端粒损耗、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍等影响细胞的生存，从而导致衰老成为诱发许多疾病的主要危险因素，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病[47,64].目前已有证据表明,伴随着细胞衰老而来的细胞内环境的变化同样影响SGs的动态过程(见图2).

自然状态下的细胞衰老会随着细胞增殖逐渐累积不利于细胞生存的环境条件，是一个慢性应激的过程.随着细胞进入衰老，急性应激条件下仍能形成SGs，但在慢性氧化应激下SGs 的数量会减少甚至无法形成SGs，这是由于在慢性应激下促进SGs解聚的热休克蛋白HSP70和自噬蛋白ATG5表达上调，导致SGs被大量清除[77,89-90].这些发现表明，衰老细胞能够根据施加压力的性质改变SG动态过程，影响SG功能和完整性.

但有趣的是，即使敲低HSP70和ATG5，衰老细胞中慢性应激下SGs数量仍很少，可能还有其他通路影响SGs的形成或清除.Moujaber等[91]的工作则证明了这一点，他们发现细胞衰老通过下调转录因子Sp1和蛋白磷酸酶1的亚基CReP水平，前者调节SGs核心蛋白G3BP1(Ras-GAP SH3-binding protein 1)和TIA-1(T-cell-restricted intracellular antigen-1)丰度，后者抑制eIF2α应激依赖性磷酸化，从而降低G3BP1和TIA-1水平，抑制SGs形成.

尽管衰老细胞对慢性应激和急性应激的响应不同，但它们调节SGs的能力和对应激的适应能力普遍受损.这可以部分解释为什么衰老细胞从压力中恢复得比非衰老细胞慢，以及压力与衰老相关疾病的高度相关性.

4.2 细胞衰老促进应激颗粒组分形成不溶性聚集体

细胞衰老的过程与多种细胞生理活动的失调有关，包括蛋白质稳态失衡、细胞内pH值降低和活性氧增加[92-93].这种细胞内环境的变化在衰老过程中会进一步影响SGs的形成：1)影响蛋白的相分离行为导致改变与其互作蛋白的结合亲和性，从而被招募到SGs中，反过来又会影响SGs组成、物理性质和结构组织，包括内在无序蛋白的浓度，使其更倾向于不溶性相转变，如前述的FUS，TDP-43[69,94].2)包括活性氧在内的氧化应激是公认的SGs主要诱导因素之一，SGs被氧化应激诱导组装，并在细胞解除或适应应激后解聚，而在持续氧化应激中招募并稳定一些病理性寡聚化的RBPs，促使这些RBPs形成聚集体，如SOD1和Tau[95-96].3)SGs的正常功能发挥需要分子伴侣介导的监测机制，以免SGs持续存在损害细胞正常翻译.HSPB8-BAG3-HSP70伴侣复合物是SGs组成和动态的关键调节剂，然而这种监测机制在细胞衰老过程中，由于HSP70活性下降被破坏，使得错误折叠的蛋白质和有缺陷的核糖体产物就会在SGs中积累，并随着有缺陷的SGs解聚引发异常的相分离[97-98].4)SGs的组装、解聚和清除都需要消耗能量，因此，伴随细胞衰老的线粒体功能障碍及营养感知失调很有可能损害SGs的动态过程，甚至可能引起SGs或其中某些与疾病相关蛋白的异常相分离[99].

有证据显示，衰老过程中的慢性应激会促进核RBPs FUS和PAB-1的出核，导致核RBPs在胞质中形成不溶性聚集体，而在通过减少IIS信号介导的长寿线虫里HSF-1和DAF16被激活，从而消除这些蛋白质聚集体[83].这些都提示，在衰老过程中衰老细胞的内环境和代谢变化，会使得细胞监控系统受到干扰，从而可能影响SGs动力学，导致异常蛋白质聚集体易于形成.此外，与年龄性神经退行性疾病相关的RBPs突变同样能引起SGs聚集和清除等动力学的异常[71,79,85]，但RBPs的突变先引起SGs的动力学异常而导致疾病发生，还是先诱导疾病发生使SGs异常从而促进疾病发展，目前还没有明确的定论，但无法否认的是，神经退行性疾病与异常SGs之间联系紧密.

5 总结与展望

SGs是由LLPS驱动形成的一种压力诱导的动态颗粒，由于其动态的蛋白互作网络，SGs对环境变化非常敏感，使细胞能够更灵活地应对这些变化，从而促进细胞在压力下的生存.任何改变SGs关键组分的浓度、定位和结构构象的机制都将影响SGs的形成和动力学，导致其异常相分离[65-66].正常条件下，细胞受到应激形成SGs，并在应激撤去后解聚SGs，若形成异常SGs，则在PQC的调控下被靶向溶酶体或蛋白酶体清除.正常SGs通过隔离衰老调控因子延缓细胞衰老，而异常SGs由于无法被及时清除导致疾病发生.含有TDP-43，FUS或Ataxin-2的RBPs聚集是多种神经退行性疾病的关键特征，并且在其中发现一些SGs标记物，揭示了患者病理性RBPs聚集体的积累可能是SGs调节功能障碍所致[86-88,100].这些易于聚集的蛋白可以被招募到SGs中，起到成核作用，可能导致在细胞应激期间和应激消退后出现异常的SGs，难以解聚或被清除.而这些异常的SGs可能促进衰老细胞中不可逆的成熟蛋白质聚集体，加上细胞随着年龄的增长抗压能力降低，进一步加速这些蛋白细胞功能的衰退.因此，维持适当的SG动态可能是延缓衰老和延长寿命的一种潜在策略.

另一方面在年轻个体中，多种细胞防御系统可以保护细胞免受损害变化的影响，如蛋白质稳态紊乱和活性氧增加，因此，衰老细胞(至少是那些由急性应激激活p53诱导衰老的细胞)能被免疫系统有效地清除[101].然而随着年龄的增长，一些衰老细胞获得了逃脱清除的能力，随着年龄的增加而逐年积累，不仅导致组织再生和修复的减少[5]，还无法及时“修正”细胞内的异常，这种系统的年龄依赖性故障可能导致正常SGs组装、解聚和清除方面的缺陷，这进而可能导致相关疾病的发生.目前比较确定的是，衰老细胞在急性应激中通过形成相对较多的SGs来响应应激，但无法清除已形成的SGs，极易形成不溶性聚集体导致衰老相关疾病发生；而暴露在慢性应激或持续性应激下的衰老细胞形成及清除SGs能力较弱，无法响应应激，导致细胞生存能力较弱.总而言之，衰老细胞的内环境恶化及功能退化抑制SGs形成，即使在急性应激下能诱导形成一定的SGs，也因为无法清除SGs而加剧甚至诱发疾病.目前还无法很好地解释二者的差异，因此进一步的研究将有助于揭示SGs与衰老相互作用的机制，比如慢性应激与急性应激下，衰老细胞内环境变化引起的SGs组成成分差异，以及动态分析这些差异对SGs性能变化，而这些变化是否会产生协同效应，从而加速衰老.从这些研究中确定的关键成分可能产生新的检测衰老标志物和有价值的药物靶点，用于治疗与衰老相关的疾病.另外，进一步了解幼龄和老龄动物SGs动力学调控的分子机制，同样有助于识别对抗年龄相关性神经退行性疾病的治疗新靶点.