不同稀释液及稀释比例对关中奶山羊精液低温保存效果的影响

李会玲，邹家浩，雷 博，李德娴，王 广，张永涛，李 广*

(1.陕西省畜牧技术推广总站，西安 710016；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

关中奶山羊是目前世界上最为优秀的奶山羊品种之一，具有体型结实匀称、遗传性能稳定、产奶量高、奶质优良、适应性强等特点。对良种奶山羊精液进行低温稀释保存能极大程度的提高优良公畜的利用率并降低繁殖成本，对人工授精技术的推广以及奶山羊良种化进程有很大的推动作用[1]。精液稀释液必须能为精子提供能量、营养物质、适宜的渗透压和pH等必须的生存条件，并增强精子存活率、延长精子在低温环境下的保存时间，以便于精子的运输保存及人工授精使用[2]。同时，精液稀释时会使精液中的自然抗氧化剂、脂肪酸类物质等重要成分的浓度改变，导致精子聚集、结构受损等问题，影响精液保存效果[3]。本试验拟通过对不同稀释液对奶山羊精子在4 ℃环境下精子活率和精子存活时间进行比较，以筛选出最佳的奶山羊低温保存稀释液配方；同时利用该配方进一步筛选关中奶山羊精液低温保存最佳稀释比例。以期为关中奶山羊优良种质资源的高效推广利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

试验用精液均采自陕西三原县某种羊场的3只配种用优秀关中奶山羊，年龄均为3岁，身体健康，体型结实，性欲旺盛。正常饲养，自由饮水。

无水葡萄糖，购自上海联硕生物科技有限公司；乳糖，购自上海信裕生物科技有限公司；柠檬酸钠、Tris(三羟基甲氨基甲烷)，购自Amresco公司；青霉素、链霉素、大豆卵磷脂，购自上海信帆生物科技有限公司；双蒸水，自制；生理盐水及新鲜鸡蛋。

1.2 稀释液配方

根据吴爽等[4-6]的相关研究，结合前期试验对配方进行调整，选择6种奶山羊低温保存稀释液配方(A、B、C、D、E和F)，具体配方如表1所示。按照表1的比例称取各种试剂药品，用双蒸水进行溶解，溶解后用滤器过滤备用。取新鲜鸡蛋，用酒精棉球擦拭蛋壳进行清洁消毒，待干燥后敲碎气室端蛋壳，去掉蛋清取出卵黄，用无菌注射器刺破卵黄膜抽取卵黄，按表1的比例加到上述配制好的溶液中，并用磁力搅拌器搅拌至溶液均匀。所有配方配制完成后加入青霉素和链霉素，置于38 ℃水浴锅中预热备用。

1.3 精液采集与稀释

使用假阴道法进行精液的采集，精液采出后，立即在35～38 ℃下镜检，所采集的精液必须没有异物，没有异常气味，色泽为乳白色或乳黄色，精子形态正常，精子活力在0.8以上，密度达到15亿/mL以上，在显微镜下呈现“云雾状”者方可用于下一步进行稀释。

镜检合格的精液等量分装于无菌的离心管中，分别加入预热好的6种稀释液做2次1∶1的稀释，2次稀释时间间隔5 min，并编号标记，稀释完成后用16层纱布包裹置于4 ℃冰箱中保存，每3 h缓慢翻动1次离心管，防止精子沉淀，每6 h对精液进行1次镜检，直至精子全部死亡，统计各组精子各个时间段的活率、有效存活时间及总存活时间。

1.4 效果判定

精子活率指直线运动的精子数占总精子数的百分比；精子有效存活时间指精子活率高于0.3的保存时间。精子活率的检测借助CASA系统进行，每次试验做3组重复，试验数据使用Excel进行统计记录，并采用SPSS 26.0统计软件进行差异显著性分析，结果均以“平均值±标准差”表示。P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同稀释液对关中奶山羊精子活率的影响

由表2可知，精子在4 ℃条件低温保存时，同种稀释液中，精子活率随着保存时间的增长而降低；相同保存时间下，在试验前12 h，C组和E组精子活率显著高于其他4组(P<0.05)，12 h后C组精子活率显著高于其他5组(P<0.05)。

表2 不同稀释液对关中奶山羊精子活率的影响

2.2 不同稀释液对关中奶山羊精子存活时间的影响

由表3可知，在4 ℃环境下不同组别的稀释液对精子存活时间的影响差异显著，C组精子有效存活时间和总存活时间均显著优于其他5组(P<0.05)。

表3 不同稀释液对关中奶山羊精子存活时间的影响

2.3 不同稀释比例对关中奶山羊精子活率的影响

使用C组稀释液对关中奶山羊进行不同比例的稀释。由表4可知，关中奶山羊精子在4 ℃条件低温保存时，在试验前12 h，各组间精子活率差异不显著；在18～60 h之间，以1∶4、1∶8的稀释比例进行稀释的精液，精子活率情况较其他组有明显优势，尤其随时间增长，精子活率显著高于其他组(P<0.05)；在60 h之后，以1∶8的比例进行稀释的精液精子活率显著高于稀释比例为1∶4的一组(P<0.05)。

表4 不同稀释比例对关中奶山羊精子活率的影响

2.4 不同稀释比例对关中奶山羊精子存活时间的影响

由表5可知，在4 ℃环境下，使用C组稀释液进行稀释后，不同稀释比例对精子存活时间的影响差异显著，其中以1∶8的比例进行稀释的精液，精子的有效存活时间和总存活时间均显著优于其他4组(P<0.05)。

表5 不同稀释液对关中奶山羊精子存活时间的影响

3 讨 论

精子活率是保证精子能顺利通过雌性动物生殖道与卵子结合成功受精的重要条件，稀释后精子的有效存活时间是保证精子能进行较长时间保存和运输的重要条件，两者是判断稀释液效果优劣的重要指标[7-8]。本次试验根据精子活率和有效存活时间对稀释液效果进行比较，可以看出C组稀释液保存效果明显优于其他5组(P<0.05)，且稀释比例为1∶8时精子的保存效果显著优于以其他比例进行稀释的4组。

随着保存时间的延长，精子的代谢产物如乳酸和二氧化碳也不断累积，精液的pH会有所降低，对精子造成酸损伤，精子的运动性能随之下降，导致保存品质同时下降[9]。而在稀释液中选用稳定的缓冲物质能起到稳定精液的pH的作用，有利于精液进一步保存。王俊峰[10]研究认为Tris作为冷冻稀释液的缓冲物质在绵羊的精液冷冻中起到很好的缓冲作用；施会彬等[11]使用以柠檬酸钠为缓冲物质的稀释液在羊精子的低温保存上取得较为突出的效果；薛昌安等[12]将Tris和柠檬酸配合使用，在山羊精液保存上效果突出。本试验中通过B组、C组和E组稀释液效果的比较可以看出，以柠檬酸钠作为主要缓冲物质的C组稀释液效果优于以Tris作为缓冲物质的B组以及使用Tris和柠檬酸钠配合使用的E组稀释液的效果。但缓冲物质的最优添加比例有待于进一步探究。

卵黄是哺乳动物精液稀释液中重要的非渗透性保护剂。卵黄中含有的卵磷脂是保护精子的主要物质。首先，其保护作用体现在对精子的能量供给方面，其次，卵黄中含有的卵磷脂融点较低，在进入到精子的内部结构中后，能够代替醛磷脂，具有在低温环境下不易冻结的物性，因此能够保护精子低温条件下良好的生存[13-14]。但是在卵黄的使用方面仍存在问题，卵黄中可能存在的微生物增加了稀释液被污染的危险，卵黄成分过于复杂，且山羊精液中含有卵黄凝集，有资料报道卵黄凝集能与卵黄中卵磷脂发生反应产生凝集，使用大豆卵磷脂代替卵黄效果更好[15]。本试验中通过C组和D组稀释液效果的比较可以看出，卵黄在稀释液中的使用效果明显优于大豆卵磷脂，这可能与大豆卵磷脂的溶解性有关。而通过A组和B组的对比可以看出在稀释液中添加10%和15%的卵黄，短时间内对精子活力的没有显著影响，在对精子存活时间的影响上，在稀释液中添加15%卵黄优于10%的卵黄，但是差异不显著，这可能与随着保存时间的延长，精子的能量损耗有关。

精液的稀释比例对精液的长期保存具有明显的影响，稀释比例较小，精子密度较大，随着精子不断代谢导致营养物质无法满足精子的长期存活，同时高密度的精液中精子互相碰撞也会造成一定的物理损伤，除此以外，高密度精子代谢产生的不利影响较大[16]。而精液稀释比例过大，精子易受稀释打击，导致有效精子数降低，进一步影响人工授精质量[17]。刘福元等[18]研究表明，在萨福克羊精液低温液态保存的过程中，以8倍稀释后的精液的保存效果最佳；吐来力江·哈木太等[19]研究表明以5，10，15倍稀释的精液保存效率最佳。而本次试验表明，在关中奶山羊的低温保存过程中，以1∶8的比例进行稀释的精液保存效果最为突出，同时在48 h之内以1∶4比例进行稀释的精液保存效果也比较突出，在实际生产应用过程中，可以根据对精液密度的不同需求选择(1∶4)～(1∶8)适当的稀释比例。

4 结 论

通过本次试验出一组效果较为突出的关中奶山羊精液低温保存稀释液，其具体配方为：每100 mL稀释液中添加无水葡萄糖3 g，乳糖4.8 g，柠檬酸钠1.6 g，卵黄15 mL，青霉素和链霉素各10万IU，同时在使用该稀释液时的最佳稀释比例为1∶8。