影响牛胚胎移植效果的主要因素分析

鲁立刚，刘 江，曾继晶，徐照学

(1.毕节市畜牧兽医科学研究所，贵州 毕节 551700；2.毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 551700；3.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450008)

1890年，英国剑桥大学的Walter Heape将2枚纯种安哥拉兔的4细胞胚胎移植到另一只已交配3 h的比利时兔的输卵管内，结果生出4只比利时仔兔和2只纯种安哥拉仔兔，胚胎移植技术由此创立[1]。此后的几十年间，胚胎移植技术在小白鼠、大白鼠以及猪、牛、马、绵羊、山羊等家畜上取得成功，揭开了胚胎移植技术服务于畜牧生产的新篇章。随着理论研究和畜牧科技的迅速发展，胚胎移植技术得以不断扩展与完善，成为现代畜牧业尤其是高价值低繁殖力畜种繁育中不可或缺的技术手段。

牛是单胎大家畜，其繁殖周期较长，繁殖力较低，用胚胎移植技术进行扩繁效果好，并且供受体牛均可反复使用，因此牛的胚胎移植技术在实际生产中得以广泛应用。但由于胚胎移植是一个系统工程，受诸多因素影响，移植效果也参差不齐。本文就影响牛胚胎移植效果的主要因素进行简要分析，以期为提高牛胚胎移植的效果提供参考。

1 供受体牛选择

1.1 供体牛选择

总体原则是根据胚胎移植的目的选择供体。对于以育种纯繁为目的的胚胎移植，在供体牛的选择上主要考虑遗传性状、系谱关系、品种特性和生产性能，比如生长速度、产奶量等；对于以扩繁、增加群体数量等常规畜牧生产为目的的胚胎移植，在供体牛的选择上主要侧重于繁殖状况、使用年限等。

此外，供体的选择还决定着胚胎的数量与质量。由于囊胚期前的胚胎发育主要靠母系遗传物质来维持，只有当受精卵运用自己的基因组而不再是母系遗传物质时才能够进入囊胚发育期阶段[2]。因此，在选择供体时，还要考虑其能否提供优质的卵母细胞，这样才能获得优质的早期胚胎，提高母系遗传物质与受体之间建立信号通路的成功率，进而提高后期的着床率。

Seidel等人证明，在具有3次以上采卵经历的供体母牛中，有19%～38%的牛所产的正常形态胚胎移植妊娠率极低或从不妊娠，西贝[3]将这种在牛胚胎移植中供体牛生产的形态正常的胚胎却从不妊娠的现象称为“供体牛效应”。

总体而言，供体牛要选择健康状况良好，生殖系统发育完善，无生殖系统疾病，无结核、布病等传染性疾病，具有正常的发情周期，膘情适中的青年母牛或者经产1胎的母牛，条件允许的情况下要尽量避免“供体牛效应”。

1.2 受体牛选择

一般情况下，能够正常发情配种产犊、具有完整的繁殖周期、体格发育正常、体况良好、体质健康的母牛都可以作为受体牛。但在生产实践中，为了保证移植效果，通常选择生殖系统发育完善、发情正常的青年母牛作为受体牛。倪俊卿等[4]对2005年至2016年近12年的受体牛相关数据分析得出：青年母牛作为受体牛的妊娠率高于经产母牛。

此外，受体牛的选择还决定着母体对胚胎信号的反应速率及胎儿的营养状况。胚胎自着床起就开始与受体建立营养联系，在发育早期胚胎需要的营养比较少，这时所选择的受体表现出来的差异很小；但随着胚胎的发育，对营养的需求越来越大，这时所选择的受体对胎儿发育表现出明显的影响。有研究表明：在胚胎移植后到着床这一阶段，是胚胎移植能否成功的关键阶段，其失败率占整个胚胎移植失败率的30%～70%[5]。并且受体与移植妊娠率、产犊初生重等指标有直接的关联[6]。此外，随着受体黄体品质等级的下降，其妊娠率呈明显的下降趋势[7-8]。同时，卵巢有无弹性也影响着受体的妊娠率(分别为61.3%和44.1%)[9]。

2 超数排卵处理效果

超数排卵是指在母牛发情周期中的适当时期人为地注射外源促性腺激素，从而促使卵巢中卵泡发育和排卵的数量大大增加的方法。在牛胚胎移植过程中，需要对供体母牛进行超数排卵处理，目的就在于能够一次取得多枚胚胎。

供体牛超数排卵方案通常有以下几种：(1)FSH+PG法；(2)FSH+PG+GnRH法；(3)FSH+PG+CIDR+GnRH法；(4)PMSG+PG法。

上述超数排卵处理方案(1)至(3)处理效果也有所差异。李金辉等[10]用FSH+PG法处理供体牛获得头均可用胚数4.2枚左右；刘俊平等[11-12]用FSH+PG+GnRH法处理供体牛获得头均可用胚数6.2枚左右；乔海生等[12]用CIDR+GnRH+FSH+PGF法处理供体牛获可用胚数为5.4～8.8枚。由于方案(4)PMSG的半衰期过长，可以导致卵巢的过度刺激以及对排卵、受精和随后的胚胎发育产生不利的影响，因此现在一般已不采用PMSG对奶牛进行超排处理[13]。董文听等[14]用(1)至(3)3种方案对放牧条件下西门塔尔牛进行超排处理，结果以FSH+PG+CIDR+GnRH法最好，头均回收可用胚胎数为：国产FSH(7.21±3.19)枚、进口FSH(7.79±4.23)枚。FSH+PG+GnRH法次之，头均回收可用胚胎数为：国产FSH(5.93±3.54)枚、进口FSH(6.76±3.79)枚。FSH+PG法效果最差，头均回收可用胚胎数为：国产FSH(3.43±2.41)枚、进口FSH(4.34±2.71)枚。国产FSH与进口FSH超排效果差异不显著。但秦殿武等[15]采用国产(宁波)和加拿大进口的FSH制剂对草原红牛进行超排发现：进口的FSH超排效果要优于国产的(差异显著)。究其原因主要是商品FSH在制备提取过程中，不同厂家生产的FSH纯度有差异；即便是同一厂家，不同生产批号的FSH超排效果也不尽相同。这一结论与朱玉林等的研究结果[13]是一致的。

另有研究表明：在超排处理中运用GnRH及其类似物可以提高超排效果。Foote等报道，用FSH超排后发情当天肌肉注射GnRH采到的胚胎总数和受精率均高于未注射GnRH组[16]。

此外，牛的超排效果和摄入的营养水平也有很大关系。G．K．MackDonald报道：在奶牛超排处理前2周，降低日粮的蛋白水平(将蛋白水平降至12%)，增加能量水平(补饲大麦、玉米等高能量饲料)，以及适当补充复合维生素制剂，能够有效提高其超排效果。

3 胚胎质量

胚胎从生产方式上可分为体内胚胎和体外胚胎；从保存形式上可分为新鲜胚胎和冷冻胚胎。根据形态学标准，胚胎按质量优劣可分为A、B、C、D 4个等级[17-22]。一般而言，A、B、C级为可用胚胎，但C级胚胎移植成功率较低，D级胚胎不宜移植。A、B级胚胎可作冷冻，C、D级胚胎不能作冷冻。

据Broadbent、西贝等相关研究报道：相同等级的胚胎，鲜胚移植比冻胚移植的妊娠率要高8.5%～14.0%，并且无论是鲜胚或者冻胚(从A级到C级)，胚胎质量等级越高，移植妊娠率越高。

4 供受体的同期性

在胚胎移植中，供体牛只负责生产胚胎，妊娠产犊这一过程则是由受体牛来完成的。因此，供体牛和受体牛的同期性对胚胎移植效果起着至关重要的作用。供体牛和受体牛的同期性是指二者卵巢、子宫内环境及激素水平等趋于一致或者相近，以便于胚胎从供体子宫移植到受体子宫后能够顺利着床发育。

理论上讲，供体和受体的子宫内环境越一致或者越相近，则越有利于胚胎移植后的着床，移植妊娠率也就越高。但在实际的操作过程中，由于供体和受体的个体的差异，只可能无限接近而绝无一致的可能。通常情况下，供体牛和受体牛的发情周期在±1 d内时(即将供体牛的胚胎移植给发情后第6～8天的受体牛)移植效果较为理想。有研究表明：通过对8 000多头荷斯坦青年母牛采用PGF2α诱导同期发情，发情时间早于供体牛的受体牛，其移植妊娠率高于发情时间晚于供体的受体牛，即在发情后第8天的受体牛，其移植妊娠率高于发情后第6天的受体牛。这一研究结果在自然发情的肉牛上也得到了验证(n=26 369)。其原因可能是发情后第8天的受体牛，其黄体功能更加完善。

基于此，有研究小组通过测定移植时受体牛的孕酮水平来验证上述推断，部分研究结果表明：胚移妊娠牛和不妊牛在移植时的孕酮水平没有差异(Hasler等1980，Niemann等1985，Payas等1989，Stubbings等1980)。但是，一些研究者发现：当受体母牛血液中孕酮水平为2.0～5.0 ng/mL时，移植妊娠率较高；而低于2.0 ng/mL时，移植妊娠率较低(Arave等1987，Niemann等1985，Northey等1985)。Walten等1986年报道，在胚胎移植时给受体母牛注射孕酮不能提高移植妊娠率。但是，Salgado Geiser等(1984)发现：给发情后5～6.5 d的受体牛注射孕酮或阴道放置孕酮释放装置可以提高胚移妊娠率(孕酮处理组的妊娠率为53%，对照组为37%)。Geisert等1991年也报道：给发情后5 d的受体牛注射孕酮，同时给受体牛移植8日龄的胚胎，结果表明注射孕酮可以降低由于非同期性对妊娠率的影响(注射孕酮组的妊娠率为47%，对照组仅为5%)。

因此，要提高胚胎移植妊娠率，供体牛和受体牛的同期性是关键。对于发情时间稍晚于供体胚胎日龄的受体牛(即不到发情后第7天的受体牛)，适时注射孕酮有利于受胎，但注射的确切时间还有待于更进一步研究。

5 操作技术

在胚胎移植过程中，术者的技术熟练程度也是影响胚胎移植效果的重要因素，主要表现在胚胎解冻、移植枪通过子宫颈的技巧、胚胎移植部位、是否导致子宫内膜损伤出血、以及移植所用时间等方面。

5.1 胚胎解冻

将胚胎细管从液氮中取出，置于空气中10 s，然后再将其置于35～38 ℃温水中水浴10 s，剪掉封口端后即可装枪移植。Hillier等认为，若将胚胎自液氮中取出后直接放入35～38 ℃的恒温水浴中进行解冻，胚胎易出现透明带破裂现象。

5.2 移植枪通过子宫颈的技巧

由于子宫颈的特殊褶皱结构，移植枪通过子宫颈的时候应采取试探性的方式柔性、缓慢通过。如果在前进过程中遇到阻力，则需将移植枪略微后退，调整前进方向后旋转通过，切忌用力过猛造成子宫颈损伤。

5.3 胚胎移植部位

移植枪通过子宫颈后，继续插入有黄体一侧子宫角深部1/2～1/3处，原则是在不造成子宫角损伤的前提下尽可能靠前，越深越好。

5.4 移植所用时间

胚胎移植过程中所需时间主要取决于术者的技术操作熟练程度，通常应将操作时间控制在5 min内，原则上不超过10 min。

6 营养及饲养管理水平

为了提高牛胚胎移植的效果，受体牛的营养和饲养管理水平也不可忽视。

(1)在移植前受体牛最好单独组群饲养，这样既便于饲养管理又能保持养殖环境的相对稳定，减少应激的发生。

(2)在日粮搭配上，蛋白和能量水平要均衡，矿物质和维生素也不可或缺，以保证受体牛正常的营养需求，维持良好的体况和膘情。受体牛通常在移植前45 d开始补饲，保持日增重0.30～0.40 kg，同时注射VA、VB、VD、VE针剂或补饲多维、钙、磷、锌、硒等微量元素。

(3)应加强对受体牛的日常管理，驱虫、保健、免疫等常规管理措施也必不可少，保持受体牛每天有充足的运动量。

(4)产前3个月要满足对营养的全面需要，尤其是蛋白质的需要，补充足量的维生素、微量元素，适当限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产。

(5)围产期密切观察，做好受体牛分娩及产后保健、初生犊牛维护，有效降低犊牛死亡率。

7 结 语

牛的胚胎移植是一个系统工程，影响环节和因素众多，每个环节和因素都能牵一发而动全身，影响最终的移植效果。要想获得理想的移植效果，每一个环节都必须做到尽善尽美。此外，由于牛胚胎移植的成本较高，整个过程对技术要求较为苛刻，因此，不断提高牛胚胎移植妊娠率、产犊率将一直是广大畜牧科技工作者孜孜以求的奋斗目标。