非小细胞肺癌患者缺氧诱导因子、血管内皮细胞生长因子表达水平及其临床意义

贺春艳，吴月明

(锦州医科大学附属第三医院肿瘤二科，辽宁 锦州 121001)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中的常见类型，所占比例高达80%，且大多数患者在就诊时已处于疾病中晚期，5年的总体生存率较低，对患者预后的影响较大[1-2]。因此，积极的了解NSCLC的确切发病机制，在早诊断、早治疗疾病、改善预后方面占据着重要地位。缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是调节机体缺氧环境的重要指标，其中HIF-1α、HIF-2α是作用最为重要的两种因子，目前的较多研究已证实，HIF-1α在恶性肿瘤中有着广泛价值，可促使肿瘤细胞增殖、生长[3-4]。然而关于HIF-2α在恶性肿瘤中的相关作用报道较少。血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)是机体血管生成的重要指标，可促使毛细血管新生，增加肿瘤组织的灌注情况，造成肿瘤细胞周期紊乱，从而影响患者预后[5]。因此，本研究旨在探讨NSCLC患者HIF-2α、VEGF的表达水平及其临床意义，旨在为临床诊疗提供一定参考依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年3月至2021年11月我院接诊的86例NSCLC患者作为本研究对象。病例纳入标准：①符合NSCLC相关诊断标准，并通过影像学、纤维支气管镜病理学检查、病理组织学检查等确诊[6]；②病历资料完整；③签署研究知情同意书。排除标准：①已接受过放化疗；②同时伴有其他恶性肿瘤；③合并结缔组织性疾病、风湿性疾病、强直性脊柱炎等；④长期服用免疫抑制剂或伴有自身免疫性疾病；⑤伴有其他组织器官功能严重衰竭；⑥伴有精神疾患。86例中男58例,女28例，年龄47～78岁，平均(62.22±7.10)岁；肿瘤直径≥5 cm 42例、<5 cm 44例；TNM分期Ⅰ期14例、Ⅱ期28例、Ⅲ期29例、Ⅳ期15例；分化程度：低分化20例、中分化51例、高分化15例；有淋巴结转移36例、无淋巴结转移50例。本研究已通过我院伦理委员会批准实施。

1.2 标本采集及HIF-2α、VEGF检测方法 收集所有患者的NSCLC组织标本及癌旁组织(距肿瘤病灶边缘>3 cm的组织)标本，使用4%中性福尔马林溶液固定标本，常规石蜡包埋，连续性4 μm厚度进行切片，脱水处理后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)予以抗原修复，加入蒸馏水10 μl、10%过氧化氢5 μl，置于室温条件下，孵育30 min，使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行3次洗涤，每次洗涤时间3 min；分别加入HIF-2α、VEGF单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司)，置于37 ℃条件下，孵育60 min，PBS进行3次洗涤，每次洗涤时间3 min；加入经过辣根过氧化物酶(HRP)标记的HIF-2α、VEGF二抗，置于37 ℃条件下，孵育20 min，PBS进行3次洗涤，每次洗涤时间3 min，再加入二氨基联苯胺(DAB)进行显色处理，PBS冲洗、复染，脱水处理后进行观察结果。

1.3 HIF-2α、VEGF阳性率判定方法 在显微镜下进行观察，随机选择5个400倍视野，根据HIF-2α、VEGF着色强度和阳性细胞所占比例判定，其中着色为褐色、黑色记3分，棕黄色记2分，淡黄色记1分，无色记1分，阳性细胞所占比例≥75%记4分，阳性细胞所占比例<75%且≥51%记3分，阳性细胞所占比例<51%且≥11%记2分，阳性细胞所占比例<11%则记1分，无阳性细胞则记0分，将两者结果相乘，总分≥3分则判定为阳性表达，<3分则为阴性表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计数资料以[例(%)]表示，比较采用χ2检验，HIF-2α和VEGF的相关性采用Spearman等级分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCLC组织和癌旁组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率比较 NSCLC组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率均明显高于癌旁组织，比较差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 NSCLC组织和癌旁组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率比较[例(%)]

2.2 不同临床病理NSCLC组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率比较 HIF-2α、VEGF在不同性别、年龄中的阳性表达率比较差异无统计学意义(均P>0.05)，肿瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移患者的HIF-2α、VEGF阳性表达率明显高于肿瘤直径<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移患者，比较差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 不同临床病理NSCLC组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率比较[例(%)]

续 表

2.3 HIF-2α和VEGF相关性分析 经过Spearman等级相关性分析显示，HIF-2α和VEGF之间呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 HIF-2α和VEGF相关性分析(例)

3 讨 论

随着人们生活习惯的不断改变，NSCLC已在临床上呈现出较高的发病率及病死率，极大的影响着患者的预后，早期接受手术切除病灶是治愈患者的重要方案，但NSCLC的早期症状不明显，多数患者在医院就诊时已处于病情中晚期，丧失了根治性切除手术机会。而积极了解NSCLC的发病机制在指导临床治疗、改善预后方面显得十分重要[7-8]。

国内外均有研究显示，缺氧是实体肿瘤恶性增殖过程中十分常见的现象，也是促使肿瘤进展的一种重要生理改变，主要是由于肿瘤细胞会营造一种低氧环境，并刺激白细胞介素-6、转化生长因子等细胞因子分泌，再通过一系列途径发挥促进肿瘤生长、增殖、转移等作用，最终导致疾病恶化[9-10]。HIF是一种人体中普遍存在的转录因子，其表达主要受到细胞外氧分压的调控，是反映机体缺氧程度的重要指标，既往的研究多着重于HIF-1α在肿瘤组织中的作用[11-12]。但关于HIF-2α的报道较为欠缺，HIF-2α主要作用是主导着机体的慢性缺氧情况，主要表达于血管内皮细胞、肺泡Ⅱ细胞、巨噬细胞等中，而近年来关于其在恶性肿瘤中的作用也备受学者重视，我国有研究显示，HIF-2α基因单核苷酸多态性和胃癌易感性之间存在着密切联系[13]。国外有相关报道也发现，HIF-2α对肿瘤微环境也具有调节作用，参与着恶性肿瘤的发生及发展等过程[14]。此外，新生血管生成也是肿瘤发生、发展的重要环节，和肿瘤浸润、转移密切相关，VEGF是评价机体血管生成的重要指标，除具有促进血管生成的作用之外，还能够加强血管侧枝循环的建立功能，损伤血管内皮细胞，从而促使肿瘤进展。目前的较多报道也发现，VEGF在乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤中均有着高表达的阳性率，且和淋巴结转移等不良预后有着明显相关性[15-16]。

本研究通过观察发现，NSCLC组织中HIF-2α、VEGF阳性表达率明显高于癌旁组织，且在中瘤直径≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移患者中，HIF-2α、VEGF阳性表达率也明显高于肿瘤直径<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移的患者，结果存在着明显差异。通过分析是由于，肿瘤组织持续性的处于一种慢性缺氧环境下，此过程会逐渐增加HIF-2α的表达，导致肿瘤组织中HIF-2α阳性率出现明显升高；Albadari 等[17]研究也显示，HIF-2α可通过上调一些促癌基因的表达，在肿瘤细胞适应低氧环境中发挥着重要作用；另也有相关文献表明，HIF-2α除能反映缺氧状况之外，也具有诱导肿瘤血管生成、调控血管功能的作用[18]。此外，肿瘤细胞的生长会依赖于血管的滋养供应，随着VEGF表达升高，新生血管的增加，可进一步加强肿瘤细胞的浸润、转移能力，促使肿瘤组织血流动力学紊乱，最终导致肿瘤进展，影响患者预后。雷芸等[19]实验中也证实，NSCLC组织中VEGF的阳性表达率为72.22%，和本研究中的69.77%结果相近，且该研究中也显示出VEGF和患者TNM分期、淋巴结转移等密切相关。

本研究通过进一步相关性分析也显示，HIF-2α和VEGF之间呈明显的正相关，主要原因分析如下，肿瘤发生后组织会出现缺氧情况，在缺氧状态下会启动血管生成反应，而随着新生血管的生成，组织缺氧现象会随之加重，两者之间有着相辅相成的作用，形成一种恶性循环，共同促进了NSCLC患者病情的进一步进展。近年来，临床上逐渐开展了较多以抗VEGF为靶点治疗的研究，也取得了较好的成效[20-21]，而和HIF-2α相关的靶点研究报道仍较少，但本研究也为今后临床治疗NSCLC的靶向治疗提供了一个新的方向，笔者也认为，今后在NSCLC患者的诊治中，可通过检测HIF-2α、VEGF表达来评估患者预后，也有利于早期开展相关治疗。但是本研究也存在不足，例如未能分析两者与患者预后、治疗效果、生存率方面的影响等，且总体样本量较少、样本来源单一，今后也有待开展更高质量的研究。

综上所述，NSCLC组织中HIF-2α、VEGF表达明显升高，且和肿瘤直径、TNM分期、分化程度、淋巴结转移之间密切相关，临床上应予以重视，本研究也为今后临床靶向治疗NSCLC提供了新思路。