去细胞异种神经支架对大鼠足底创面触觉功能重建的影响及机制研究

樊 力，冯 亮

(陕西省核工业二一五医院手足外科，陕西 咸阳 712000)

足底是机体重要的组织器官之一，包括足跟、足外侧部分、跖趾关节，具有吸收震荡、负重、行走等多种功能[1]。足底损伤形成创面是临床外科的常见病和多发病，伴功能障碍、疼痛、感染等多种并发症，也严重影响机体的身心健康。足底创面修复除了要注重耐磨、耐压外，尤其需要重视足底的触觉功能恢复，为此在修复选择中要合理选择恢复感觉功能的方法，防止足底及足后跟功能障碍[2-3]。当前临床上多采用皮瓣移植、电磁疗法、高压氧等多种治疗手段促进足底创面修复，但是很多机体在创面修复区往往出现触觉功能的丧失，从而导致创面修复失败。随着医学技术的发展，组织再生技术得到了广泛应用，其能促进创面修复、再生和功能恢复[4]。其中触觉与默克尔细胞(Merkel细胞)存在于表皮与真皮交界的网状脊上，可与感觉传入神经纤维末梢紧密接触，在皮肤触觉高敏感区域数量较多，形成类似于神经解剖上突触结构，可用于创面修复[5-6]。但是很多细胞工程在修复中容易出现免疫排斥反应，主要在于基质携带有组织相容性复合抗原。去细胞异种神经支架采用了化学萃取方法去除异种神经的细胞和髓鞘形成无细胞基质膜管，抑制了异体移植的免疫反应，又能有效地促进损伤神经的再生与修复[7]。且去细胞异种神经支架不受取材限制，具有促进轴突再生，能够有效减少免疫排斥反应的发生[8]。本文具体探讨与分析了去细胞异种神经支架对大鼠足底创面触觉功能重建的影响，并简单阐述了相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物 清洁级成年雄性Sprague-Dawly大鼠购自上海闵盛医疗科技有限公司，使用许可SYXK(沪)2021-0020。雄性，3月龄，体重180～220 g。所有大鼠均在标准环境下饲养，通风良好，自然采光，每4～6只一笼饲养，普通饲料与垫料，明暗时间设定为12 h∶12 h，可自由摄取食物和水，湿度60%～70%，室温控制在(22±1)℃。动物实验经由实验动物医学伦理委员会批准，实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。大鼠在饲养环境中适应7 d后进行后续实验。

痛觉测试仪购自香港友诚生物科技有限公司；肌源性干细胞、去细胞异种神经支架保存于本实验室；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶(批号：S9020、T8150、31600，均购自Solarbio公司)；兔抗大鼠细胞角蛋白-20(Cytokeratin-20，CK-20)单克隆抗体、兔抗大鼠β-actin单克隆抗体、兔抗大鼠代谢型谷氨酸受体5(Metabotropic glutamate receptors，mGluR5)单克隆抗体(批号：ab76126、ab8226、ab76316，均购自英国Abcam公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0012S，购自上海碧云天生物科技有限公司)；多聚甲醛、无水乙醇[批号：441244、1012772，均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]。

1.2 大鼠足底创面模型的建立 大鼠腹腔内注射4.0%水合氯醛(10.0 ml/kg)，麻醉成功后，0.5%聚维酮碘溶液消毒大鼠足底，然后逐层深切，确保切除深度达筋膜层6 mm×5 mm的皮肤全层，建模后大鼠分笼饲养，从而建立足底全层皮肤缺损大鼠模型。

1.3 大鼠分组与处理 将大鼠足底创面模型(n=48)随机平分为三组：模型组、干细胞组、神经支架组(肌源性干细胞+去细胞异种神经支架)。模型组不进行治疗，干细胞组将培养良好的肌源性干细胞(浓度为107个/ml)细胞悬液注射到创伤部位，神经支架组在干细胞组治疗的基础上以注射植入后的细胞异种神经支架进行桥接，吻合口以9-0丝线吻合。所有大鼠皮下注射抗菌药物以防止局部感染。

1.4 观察指标 ①所有大鼠都在治疗第7天与第14天进行足底创面机械痛阈测定：将大鼠单独置于鼠笼中，安静放置1 h适应周围环境后，采用弗莱毛分别测试大鼠的机械痛阈(检测区域固定在足底创面中央)，每种型号弗莱毛刺激10次，以出现5次以上缩脚反应为阳性，其中能够引发迅速缩脚反应的最小力度为机械性痛阈阈值。②所有大鼠在治疗第7天与第14天进行步态测定:测定与记录足底神经指数，0为正常值，-100为完全离断。同时用肌电图仪检测足底神经的运动神经传导速度。③三组分别与治疗第14天与第21天分别处死8只大鼠，取大鼠足底创面新生肉芽组织，置于4.0%多聚甲醛溶液中后制成病理切片，1.0%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，树脂包埋，使用Image 5.0图像分析软件进行定量测量，计算与记录同一平均面积的有髓神经纤维数量。④大鼠足底创面新生肉芽组织，研磨后提取总蛋白，离心后取上清液，进行蛋白定量，上样后电泳2.5 h，将目的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶中室温封闭1 h；加入一抗抗体(1∶1000)，孵育(4 ℃，过夜)，TBST洗涤3次，二抗室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL显影后进行曝光，确定目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.00统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素或多因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 机械痛阈变化比较 干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的机械痛阈高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)，见表1。

2.2 足底神经指数与运动神经传导速度变化比较 干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的足底神经指数与运动神经传导速度高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)，见表2。

2.3 有髓神经纤维数量变化比较 干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的有髓神经纤维数量高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)，见表3。

表1 三组治疗后不同时间点机械痛阈变化比较(g)

表2 三组治疗后不同时间点足底神经指数与运动神经传导速度变化比较

2.4 CK-20与mGluR5蛋白相对表达水平比较 干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的CK-20与mGluR5蛋白相对表达水平低于模型组(均P<0.05)，神经支架组低于干细胞组(P<0.05)，见表4。

3 讨 论

皮肤是体内与体外环境接触的重要媒介，尤其是足底皮肤上存在大量复杂的触觉感受器，可帮助机体感知外环境的变化刺激。足底创伤在临床上比较常见，多为外伤导致，其在修复时要求重建感觉[9]。皮瓣修复的成功率比较高，但是很难改善机体的足底感觉功能。随着医学技术的发展，运用组织工程技术进行创面修复得到了广泛应用[10]。肌源性干细胞作为种子细胞用于制备组织化神经在实验研究中取得了很好的效果。而去细胞基质是近年来在各学科受到重视的生物衍生材料，具有更好的生物相容性，有利于组织、器官的修复[11]。

表4 三组治疗后不同时间点CK-20与mGluR5蛋白相对表达水平比较

本研究显示干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的机械痛阈高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)；干细胞组、神经支架组治疗第7天与第14天的足底神经指数与运动神经传导速度高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)，表明去细胞异种神经支架在大鼠足底创面的应用有利于触觉功能重建，提高足底神经指数与运动神经传导速度。从机制上分析，去细胞异种神经支架保留了基底膜、外膜、神经内膜、神经束膜等组织，清除了相关细胞和髓鞘及其碎片，具有完整的神经基底膜管和纤维支架结构，可保护受损神经元生存，降低免疫排斥反应的发生率，从而促进创面触觉功能恢复[12-13]。

触觉感受器可以通过机械激活的离子通道等把机械信号转变为感受器上的电信号形成感受器电位，然后传输高级神经中枢，产生触摸感觉[14]。生物工程材料是指天然生物组织经过特殊处理后形成的一种生物材料，其中去细胞异种神经支架具有很好的安全性，不会引起与加重炎性反应，具有良好的生物相容性与空间结构，适用于组织工程化人工神经的研制[15]。本研究显示干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的有髓神经纤维数量高于模型组(均P<0.05)，神经支架组高于干细胞组(P<0.05)，表明去细胞异种神经支架在大鼠足底创面的应用能增加有髓神经纤维数量。当前也有研究显示去细胞异种神经支架促进其分泌神经生长所需活性物质，还可促进神经细胞分裂增殖，从而更有效地促进神经再生修复[16]。并且去细胞异种神经支架还可以通过逆运输到达相应神经中枢，减少了神经元的凋亡，对中枢神经元与轴突起到一定的保护作用[17]。

CK-20蛋白是反应触觉功能的重要蛋白，正常大鼠网状脊或肉芽组织中均有CK-20阳性细胞表达，CK-20蛋白水平降低表明创面新生肉芽组织中Merkel细胞存在丢失，导致神经功能恢复能力下降[18]。mGluR5属G蛋白偶联受体超家族成员，可中介中枢神经系统兴奋性突触传递，通过神经元的中枢敏化参与神经痛的发生。 GluR5分布于脊髓和大脑的各种结构中，参与疼痛的调控以及对伤害性刺激的有效应答，在疼痛部位注射GluR5受体拮抗剂可以调控局部或全身疼痛反应[19]。去细胞异种神经支架的制作工艺简便易行，自身通透性好，来源容易，不受取材的限制。去细胞异种神经支架允许各种营养物质在管内外自由交换及血管长入，具有极低的抗原性，同时保留了促进神经再生的营养成分，为神经再生提供有利的微环境[20-21]。本研究显示干细胞组、神经支架组治疗第14天与第21天的CK-20与mGluR5蛋白相对表达水平低于模型组(均P<0.05)，神经支架组低于干细胞组(P<0.05)，表明去细胞异种神经支架在大鼠足底创面的应用能抑制CK-20与mGluR5蛋白的表达。不过本研究也存在一定的不足，动物建模中均使用成年雌性大鼠，未能体现同种族、不同性别的差异性，且大鼠行为存在随意性，将在后续研究中深入探讨。

综上所述，去细胞异种神经支架在大鼠足底创面的应用能抑制CK-20与mGluR5蛋白的表达，有利于触觉功能重建，提高足底神经指数与运动神经传导速度，增加有髓神经纤维数量。