液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定雷尼替丁及其制剂中的痕量N-亚硝基二甲胺

魏志雄 刘丹丹 蓝明雄 王昆鹏 李 儒

1.广东省东莞市食品药品检验所，广东东莞 523808；2.广东医科大学药学院，广东东莞 523000

雷尼替丁为常用的H2受体拮抗剂，能竞争性阻滞组胺与H2受体结合进而减少胃酸分泌，具有良好的临床效果，为消化性溃疡和胃酸过多等消化道疾病[1-5]的临床常用药且价格实惠。近年来雷尼替丁及二甲双胍相继报道检出N-亚硝基二甲胺（N-nitroso dimethylamine，NDMA）杂质。NDMA 被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为2A 类致癌物质，在人用药品注册技术要求国际协调会（The Inter national Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）M7 中被列为第一类基因毒性杂质，具较强的致癌、致畸和致突变毒性[6-9]。为保证药品的安全和质量可控，实现有效的风险控制，国家药品监督管理局发布《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》[10]，为亚硝胺类杂质的研究和控制提供指导。目前国内药品中NDMA 检测的文献报道[11-20]主要集中在沙坦类、二甲双胍类及替丁类等，采用静电场轨道阱（Orbitrap）高分辨质谱检测雷尼替丁中NDMA 含量方法未见报道。为进一步评估雷尼替丁及其制剂中NDMA 杂质的风险，本研究建立一种高灵敏、高质量精度的液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法（HPLC-Orbitrap HRMS）测定雷尼替丁及其制剂中NDMA 含量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Q Exactive Focus 超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪（美国Thermo fisher Scientific Inc.）；梅特勒XS205DU 电子天平（瑞士Mettler Toledo）；XW-80A 涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；CPX5800HC 超声波提取器（美国BRANSON）；WB-14 恒温水浴锅（含振荡单元，德国MEMMERT）。

1.2 试剂与材料

NDMA 对照品：Sigma-aldrich，批号：LRAC1995，浓度：5000 μg/ml（甲醇溶液）；甲醇：分析纯，广州化学试剂厂；乙腈：色谱纯，默克化学试剂有限公司，批号：JA107530；无水甲酸：色谱纯，天津科密欧试剂厂，批号：180603；水为超纯水；一次性使用无菌注射器（山东新华安得医疗用品有限公司）；0.22 μm 微孔滤膜：有机系，规格：13 mm，天津津腾实验设备有限公司。

样品共计7 批，其中5 批原料药、2 批制剂（含2批制剂对应批号辅料），均为企业委托检验提供，分别为盐酸雷尼替丁：生产企业一，批号：20171137、20170158；生产企业二，批号：20170901、20170902、20170903。盐酸雷尼替丁胶囊：生产企业三，批号：190501；生产企业四，批号：1810249。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密吸取NDMA 对照品溶液0.2 ml，置20 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为50 μg/ml 的储备液①；精密吸取对照品储备液①1 ml，置50 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 μg/ml 的储备液②；再分别精密吸取上述储备液②适量，用甲醇稀释制成1、2、5、10、20、50、75 ng/ml 的系列质量浓度对照品溶液。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 盐酸雷尼替丁样品溶液 取雷尼替丁供试品约300 mg，精密称定，置于10 ml 容量瓶中，加入5 ml 甲醇，涡旋1 min 使其溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 盐酸雷尼替丁胶囊样品溶液 精密称取样品内容物适量（约相当于雷尼替丁300 mg）至50 ml 离心管中，精密加入甲醇10 ml，涡旋混匀1 min，再振摇40 min，离心，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液即得。

2.2.3 空白试剂溶液及制剂辅料溶液 取10 ml 量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得空白试剂溶液。

2.3 测定条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ACE EXCEL 3 C18-AR（4.6 mm×100 mm，3 μm）；柱温：30℃；进样器温度：4℃；流动相A：含0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含0.1%甲酸的乙腈，按表1 梯度洗脱。流速：0.5 ml/min；进样体积：5 μl；NDMA 在3～5 min 时间段内出峰。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

2.3.2 质谱条件 采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪，扫描模式：正离子平行反应监测（positive ion parallel reaction monitoring，PRM）；以电喷雾（ESI 源）离子化，扫描范围：m/z50～95，扫描：m/z75.0553，隔离窗口：m/z1.5，碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：30。离子传输管温度：350℃；辅助气加热温度：400℃；鞘气流速：55 arb；辅助气流速：15 arb；喷雾电压：3.5 kV。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 取辅料阴性对照溶液、空白试剂溶液、对照品溶液（2 ng/ml）和样品溶液分别进样测定，与NDMA 的相同保留时间处均无干扰，见图1，表明方法的专属性良好。

图1 专属性质量色谱图

2.4.2 线性范围 取“2.1”中各系列质量浓度对照品溶液5 μl 依次注入液质联用仪，测定NDMA 峰面积，以峰面积为纵坐标“Y”，以系列质量浓度为横坐标“X”，绘制标准曲线，见图2，得到回归方程：Y=351720X-394458（r=0.9990）。结果表明NDMA 在1～75 ng/ml 范围内质量浓度与峰面积线性关系良好。

图2 NDMA 标准曲线图

2.4.3 精密度 取质量浓度为2、20 ng/ml 的对照品溶液各5 μl 分别连续6 次注入液质联用仪测定，结果显示NDMA 峰面积的RSD分别为0.5%和1.3%，表明方法精密度良好。

2.4.4 稳定性 精密吸取质量浓度为2 ng/ml 对照品溶液5 μl 分别在0、2、4、8、12 h 注入液质联用仪测定。结果显示NDMA 峰面积的RSD为1.6%，表明方法中NDMA 在12 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性 取盐酸雷尼替丁样品（批号：20170902）按“2.2.1”方法制备6 份，注入液质联用仪，记录峰面积。结果显示该批样品中NDMA 的平均含量为2.07 μg/g，RSD值为1.4%（n=6），说明方法重复性良好。

2.4.6 加标回收率 取盐酸雷尼替丁样品（批号：20170902）约300 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，精密加入浓度为1 μg/ml 的NDMA 储备液②0.3 ml，再按“2.2.1”方法制得加标回收溶液。依次精密吸取上述加标回收溶液各5 μl 注入液质联用仪测定，结果见表2，平均回收率为101.7%，RSD为2.5%（n=6），表明方法准确度良好。

表2 回收率试验结果（n=6）

2.4.7 检出限及定量限 精密吸取质量浓度为1 ng/ml的对照品溶液，用甲醇逐级稀释成不同浓度的溶液，注入液质联用仪，记录谱图。以信噪比（signal/noise，S/N）约为3 为检出限，以S/N 约为10 为定量限，结果检出浓度为0.03 ng/ml，方法检出限为0.001 μg/g；定量浓度为0.10 ng/ml，方法定量限为0.003 μg/g。

2.4.8 样品测定 按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下条件测定来自4 家企业共7 批盐酸雷尼替丁及盐酸雷尼替丁胶囊样品，测定结果见表3，相关质量色谱图见图3。

图3 相关质量色谱图

表3 样品测定结果

3 讨论

本研究进行流动相筛选时，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸的水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸的水溶液及0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸的水溶液等5个类别的梯度洗脱系统，结果表明0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸的水溶液的分离效果及质谱响应信号最好。考虑到雷尼替丁受温度及储存的影响会降解产生NDMA，应尽量避免样品在检测过程中的分解，故自动进样器温度控制为4℃。柱温选择中，考察了30、35、40℃柱温与分离效果和响应信号之间关系，试验结果表明无显著差别，本法选择30℃柱温。此外，还对样品前处理进行了考察，分别考察振摇时间为40、60、90 min 时样品的测定结果，结果无显著差异，故选择振摇时间为40 min。

按照《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》[10]规定NDMA 的可接受摄入限度为96 ng/d，盐酸雷尼替丁胶囊的最大摄入量为300 mg/d，故雷尼替丁胶囊中NDMA 的允许限度为0.32 ppm。7 批样品的检测结果显示有4 批盐酸雷尼替丁原料药和1 批盐酸雷尼替丁胶囊NDMA 含量超出允许限度，故反映该类制剂仍存在一定风险，原料药及制剂生产企业需进一步优化生产工艺，尽量降低制剂中NDMA 杂质，切实落实企业主体责任，保障患者用药安全。

综上所述，本研究采用HPLC-Orbitrap HRMS 法建立了一种测定雷尼替丁及其制剂中痕量NDMA 的检测方法。方法中NDMA 在1～75 ng/ml 范围内线性关系良好，检出浓度和定量浓度分别为0.03 ng/ml 和0.10 ng/ml，加标样品回收率97.4%～105.2%，RSD为2.5%（n=6）。本方法专属、灵敏、准确、简便，可应用于雷尼替丁类原料药及其制剂中痕量NDMA 的检测，可为生产企业的质量控制及雷尼替丁类NDMA 检测标准的制定提供参考，亦可为药监部门的监管提供技术支持。