鱼用疫苗免疫途径的研究概况(下)

蔺玉珍，王伟伟，黄孔阳，卢 武

(嵊州市甘霖镇人民政府，浙江 绍兴 312462；嵊州市畜牧业发展中心，浙江 绍兴 312400)

2.提高口服免疫效果的措施

口服疫苗免疫效果并不十分理想，主要是由于抗原受到胃酸的作用和蛋白酶的水解，使抗原到达后肠部位时，其完整性和免疫部位已被破坏或抗原被消化掉，没有足够的抗原到达后肠(Quentel C等，1997)。因此，为了使抗原在鱼的前肠不被消化，则发展了许多的包裹材料来保护抗原。现如今，常用的有海藻酸钠、明胶、聚交酯醣酯聚合物、卤虫、生物被膜等材料。

(1)海藻酸钠。海藻酸钠是一种天然多糖类化合物，是从褐藻中提取而来的，现已作为包裹药品和细胞的材料，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、黏性和安全性等特性(Chan L W等，2002)，Joosten等(1997)用海藻酸钠包裹溶藻弧菌免疫虹鳟和鲤鱼，其结果显示在鱼体中有抗体产生。Tian等(2008)用海藻酸钠包裹含有能够表达淋巴囊肿病毒蛋白的质粒进行口服免疫日本牙鲆，检测免疫3～16周牙鲆的抗体效价，表明其效果明显。Romalde等(2004)认为通过口服海藻酸钠微囊化的疫苗虽然不能作为初次免疫的方法，但对鱼有较好的保护效果。Altun等(2010)也用海藻酸钠包裹L.garvieae bacterin疫苗口服免疫虹鳟鱼，其结果表明，在免疫30天后的RPS为53%，61天后对鱼体进行二次免疫，120天时其RPS达到61%，效果明显。李新华等(2007)用海藻酸钠包裹嗜水气单胞菌疫苗口服免疫银鲫，结果表明微胶囊疫苗组血清抗体效价较高，且维持时间长，对口服免疫效果有明显的提升。

(2)聚交酯醣酯聚合物。目前，聚交酯醣酯聚合物也被应用于鱼类口服疫苗的包裹技术上，它是一种疏水型的聚酯(Tian J Y等，2008)，降解性好且无毒，而且容易生产，价格便宜。Tian等(2008)利用聚交酯醣酯聚合物包裹LCDV的DNA疫苗免疫日本牙鲆，免疫90天后，在日本牙鲆体内各组织中检测到LCDV的mRNA，而且用ELISA在1～24周均可检测到抗体。Altun等(2010)分别利用聚交酯醣酯聚合物和海藻酸钠包裹L.garvieae bacterin免疫虹鳟，聚交酯醣酯聚合物为包裹材料的免疫效果比海藻酸钠为包裹材料的好。

(3)卤虫。Campbell等(1993)利用卤虫无节幼体为载体的口服疫苗，通过ELISA方式监测鳗弧菌的摄入过程，结果表明疫苗浓度不影响卤虫的摄取速度。Gomez-Gil等(1998)认为，卤虫摄食细菌的数量是依赖死细菌的数量，同时活细菌的数量对卤虫摄食有一定的影响。Chair等(1994)用吞食有鳗弧菌的卤虫无节幼体口服免疫欧洲鲈，尽管其保护率并没有明显的提高，但是免疫后的鱼却能更好地生长，增强饲料的转化率和应对外界的各种应激。Joosten等(1995)也用卤虫无节幼体作为载体摄食鳗弧菌进行免疫不同年龄组的鲤鱼和金头鲷，口服免疫后的鱼体在10天后接受注射免疫，其结果表明，15～29日龄的鱼苗抗体水平受到抑制，而58日龄的鱼苗抗体水平有所上升；57日龄和59日龄的鲷鱼在21天后进行再次免疫，其抗体水平有显著的升高。Lin等(2005)表明用福尔马林灭活大肠杆菌表达绿脓杆菌外毒素投喂卤虫无节幼体，然后形成一种基于食物链的口服免疫系统，最后以卤虫无节幼体来口服免疫斑马鱼，30天后分别对实验组和对照组进行攻毒实验，最终免疫组的存活率为81%，而对照组的存活率为31%。

(4)其他方法。脂质体包裹疫苗可以延缓疫苗被消化、降解的时间，同时也是一种很好的疫苗佐剂，能够增强口服疫苗的免疫原性。此外，生物被膜也是一种很好的疫苗佐剂，能够保护抗原，从而能到达后肠，起到免疫保护的效果(Azad I S等，1999)。

近年来新型的植物口服疫苗也引起人们的普遍关注，与传统的疫苗相比，植物口服疫苗具有很多优势。植物本身所具有的纤维组织，可以更好地保护疫苗，防止其在前肠中消化降解(Richter L等，1999)。其表达产物能够进行正确装配和翻译后修饰加工，与天然产物的结构和生物学活性都非常相似。

三、浸泡免疫

浸泡免疫是将鱼体直接放入特定浓度的疫苗液中，经过一定时间浸泡，让抗原通过浸泡进入鱼体，刺激其产生免疫应答。浸泡免疫具有操作简单、对鱼体损伤小且可结合鱼体运输等优点。目前浸泡方式有3种，分别为高渗浸泡、直接浸泡和喷雾免疫方式。高渗浸泡是短时间利用尿素或氯化钠对鱼体进行高渗脱水，再将其放入疫苗溶液中，让鱼体能较快吸收，产生免疫反应。直接浸泡较为简单，只需要将鱼体放入疫苗溶液即可。此两种浸泡方式各有优劣，高渗浸泡能够提高鱼体摄食抗原的能力，同时也能提高鱼体的保护率，但对鱼体伤害较大，会对鱼体产生较大刺激。贺路等(1999)在实验过程中认为浸泡免疫能达到较好效果，能明显提升鱼体成活率。而Tatner等(1983)、Anderson(1979)却认为浸泡免疫效果不明显，无法起到应有的效果。喷雾免疫是利用一定浓度的疫苗溶液直接雾化喷射鱼体的一种免疫方法，最初用于弧菌疫苗免疫鱼体，且免疫鱼体大小不限，能够免疫大于20克/尾的鱼。Gould等(1978)认为喷雾压力大小不影响其免疫效果，均能达到要求。然而，喷雾免疫也存在较大不足，其操作程序较多，要经过捕捞、运送、喷雾等环节(Robles R等，1998)，会对鱼体产生较大的刺激。

其他的方法如淋浴和冲洗(Anderson D P等，1979)进行免疫鱼体，均能起到一定的效果。淋浴免疫的优势就是对免疫鱼体的刺激小，但是需要大量的疫苗(Nakanishi T等，1997)。用灭活驼背石斑鱼神经坏死病毒(HGNNV)作为疫苗来淋浴免疫橙点石斑鱼，用二甲基亚砜灭活HGNNV作为疫苗，以TCID50为107个/毫升免疫鱼体120分钟，免疫后30天和90天的相对存活率分别为87%和82%，可以很好地证明淋浴免疫的有效性(Kai Y H等，2008)。

1.浸泡免疫机理

鱼类作为低等脊椎动物，其免疫防御系统调控基因以及基因控制产物同高等脊椎动物基本相似，具有相关组织、细胞及分子行使免疫功能(Hashimoto I等，1990；Secombes C J等，1996)。系统免疫和黏膜免疫共同完成鱼类疾病的防御功能。

鱼类是生活在水环境中的群生动物，其鳃、皮肤及肠道等黏膜组织往往是与外界环境首先接触到的，并且接触面积最大(Dalmo R A等，1997)，在自然状况下，也是大多数病原入侵时首先接触的部位。因此，鱼的鳃、皮肤黏膜组织不仅具有非特异性免疫功能，同时也具有特异性的免疫应答功能(Dos Santos N M S等，2001；Xu D H等，2002)。另外，鱼的黏膜组织及其分泌黏液中含有丰富的非特异性免疫因子(Bergsson G等，2005；Mulder I E等，2007)，与特异性抗体蛋白共同构成抵御病原微生物侵入的第一道防线。解剖学研究表明，鱼的皮肤由内层的真皮层、外层的表皮、衍生物及附属结构组成，其中表皮主要由上皮细胞组成，分布有黏液细胞和囊状细胞(Press C M等，1999；Fast M D等，2002)。罗晓春等(2005)发现在斜带石斑鱼表皮和真皮层之间，游离着许多白细胞和淋巴细胞，Lobb(1987)在河鲇的皮肤中也发现有淋巴细胞的存在，利用单克隆抗体免疫组化标记技术发现，在受精两个半月以上的鲤鱼皮肤中发现一定数量的T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞。此外，Xu等(2002)研究表明，皮肤表皮中存在抗体分泌细胞。Vervarcke等(2005)用弧菌全菌疫苗浸泡非洲鲇，则在免疫鱼的体表黏液中检测到抗体蛋白。上述结果表明，在一些鱼的皮肤中存在着免疫功能细胞，但此细胞是否起源于皮肤组织，则有待于进一步的研究。另外，在鱼的皮肤组织及分泌黏液中存在许多非特异性免疫因子，如水解酶、菌酶转移因子、几丁质、C-反应蛋白、凝集素等。

鳃组织中存在有大淋巴细胞、小淋巴细胞、巨噬细胞、杯状细胞、中性粒细胞等各种细胞。Lin等(1999)认为虹鳟的鳃组织存在巨噬细胞，具有明显的吞噬活性。华育平等(2005)认为史氏鲟的鳃组织中存在溶菌酶。在大西洋鲑的鳃组织中也存在协助抗原呈递的巨噬细胞。

目前大量研究表明，黏膜免疫反应可以独立于系统免疫反应，而产生局部的免疫应答，即能够独立完成对抗原的识别、捕捉、呈递和抗体分泌等一系列反应的特异性免疫应答全过程，利用浸泡免疫能够引起鱼体的免疫过程一般以黏膜免疫反应为主。Esteve-Gassent等(2004)研究表明，浸泡免疫后鱼的鳃、皮肤和肠黏膜组织表面黏液中抗体水平、抗体分泌细胞数量均显著增加，能引起较为明显的免疫应答，而系统免疫反应较弱，且反应时间晚于黏膜组织。Moore等(1998)发现抗原的摄取量随着浸泡浓度的增加而增加。抗原主要被鳃和皮肤摄取，通过对二者的形态学观察，鳃上的抗原颗粒主要由吞噬细胞摄取，而皮肤中的抗原先出现在皮肤柱状上皮中，则可推测巨噬细胞完成抗原的识别和呈递。学者们经过不懈努力，在草鱼、斑马鱼、驼背犬齿罗非鱼、大西洋鲑等头肾中克隆到了MHCⅡ的cDNA(Walker R A等，1994)，说明鱼类存在具有功能性的MHCⅡ基因。Morrison等(2006)采用免疫组化原位标记的方法，用Neoparamoeba.sp.悬液浸泡免疫大西洋鲑，在免疫鱼鳃组织中检测到MHCⅡ阳性细胞。

根据鳃组织的细胞组成，研究者认为鳃具有独立免疫应答能力。Santos等(2001)用全菌疫苗浸泡免疫石齿鲈幼鱼，发现在免疫鱼鳃组织中不同时间点抗体分泌细胞的数量呈现应答动力学规律。同时Lumsden等(1995)用黄杆菌浸泡免疫虹鳟，通过ELISPOT检测发现鳃上的ASC要比外周血ASC的比例明显偏高。

2.提高浸泡免疫的措施

(1)超声。超声方法是在鱼类免疫途径中新应用的一种技术。超声是一种高于20 000赫兹的高频声波，方向性好、穿透力强，应用于浸泡免疫中，能够提高细胞的渗透作用。Zhou等(2002)利用超声技术将溶藻弧菌疫苗免疫青石斑鱼，在恰当的时间和恰当的频率下，发现浸泡免疫的保护效果相当于注射免疫的效果。同样关于鲷鱼方面的实验也得到了类似的结果(Zhou等，2002)。Navot等(2004)以金鱼为实验材料，比较超声技术与高渗浸泡两种方法下，鱼体对BSA的摄食量。结果表明，超声处理要比高渗浸泡的免疫效果好，而且疫苗用量是高渗浸泡的1/5。

(2)弱毒疫苗。弱毒疫苗是由致病性大为减弱的减毒株所制备的疫苗。常用的此类疫苗有VHSV的F25(21)抗热株疫苗、IHNV减毒疫苗(Fryer J L等，1976)、CCV减毒疫苗(Walczak E M等，1981)，疖疮病减毒疫苗及草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗(许淑英等，1994)等，具有免疫原性好、免疫持续期长、使用剂量小等优点，但对其安全性尚有疑虑。

四、前景展望

经过以上对注射、口服、浸泡免疫的免疫机理进行大量的阐述可以得知，注射免疫主要引起的是鱼类的系统免疫；口服免疫既可以引起系统免疫，又可以引起黏膜免疫，但主要是黏膜免疫；而浸泡免疫则主要引起的是黏膜免疫反应。免疫接种与药物治疗相比，具有安全性、无污染、在鱼体内没有残留、不会产生耐药等一系列优势。随着疫苗研究的深入，各种疫苗随即问世，如联苗、多价疫苗以及基因工程疫苗等。为了使鱼类疫苗的发展能够更科学，更有实用意义，延长其免疫应答时间(杨先乐等，1993)，研究鱼类接种疫苗后机体相关的免疫应答机理是制定生产中合理免疫方案的重要理论基础。

比较注射、口服以及浸泡免疫3种免疫途径的机理及优缺点发现，如果在未来的研究中，人们能够研发出一种既有注射免疫的免疫效果，又能避免疫苗在鱼体内的消化破坏，同时在生产实践中操作简便，使用的疫苗量也少的疫苗，不失为疫苗研究领域中的一个突破性的进展。这有待于对鱼类疫苗及鱼类免疫机理进行深入研究。

(全文完)