绿原酸合成代谢途径关键酶的生物信息学研究

冯唐锴，杨文涛

(景德镇学院 生物与环境工程学院，江西 景德镇 333000)

1 引言

金银花(Lonicerajaponica)为忍冬科忍冬属多年生半常绿木质藤本植物，通常可分为六大类。现存忍冬属植物200余种，我国约98种，其中47种可入药 ，如山银花等[1～3]。金银花药用成分包括黄酮类化合物、挥发油、三萜皂苷类化合物、无机元素类、有机酸类化合物等[4,5]，其中的绿原酸等化合物[6,7]都具有清热解毒、凉散风热功效[8]，还能抗菌、抗病毒、抗炎、促进炎性细胞吞噬功能、降血脂、使中枢神经兴奋，甚至对肉瘤S180和艾式腹水癌也有明显的细胞毒作用[9～11]。金银花起到药用功效的主要化合物为绿原酸[12～15]；目前对金银花各类药用成分合成途径的研究中，也属绿原酸最为详细[16～18]；通过各种手段影响代谢途径，提高金银花绿原酸的含量也是研究的热点[19]。因此，本研究以金银花绿原酸合成代谢途径为主要研究背景，利用生物信息学方法对植物绿原酸合成的3种关键酶进行了比较分析。希望通过此研究了解各类植物中绿原酸合成关键酶的理化性质和进化关系，为进一步深入研究绿原酸合成途径提供线索和参考。

2 材料与方法

本研究通过查阅文献资料了解绿原酸合成途径及其关键酶。从美国国家生物信息中心(National center for biotechnology information，NCBI，网址：www.ncbi.nlm.nih.gov)获取各种酶的氨基酸序列。利用ExPASy-ProtParam(网址：expasy.org/protparam/)在线软件了解金银花合成途径关键酶的理化性质。利用MEGA-7软件比对各植物同种酶蛋白氨基酸序列间的相似性及演化距离、构建系统发生树。研究于2019年9月份至2020年5月份在景德镇学院生物与环境工程学院生物化学实验室进行。

3 结果与分析

阅读文献资料[20～22]表明，绿原酸合成途径中羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(Hqt)、羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸/莽草酸羟基肉桂酰转移酶(Hct)和P-香豆酸3-羟化酶(C3h)均起着很重要的作用，是该途径的关键酶。本研究对不同植物中的这3种酶分子进行了序列检索、理化性质分析和相似性比对及建树。

3.1 序列检索及理化性质分析

3.1.1 羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸 羟基肉桂酰转移酶(Hqt)

Hqt在植物中的表达量及分布都与绿原酸含量正相关，且该酶还能在体外催化奎宁酸与咖啡酰辅酶A的缩合反应[23～25]。本研究下载了10种植物的Hqt氨基酸序列信息，利用在线软件ExPASy-ProtParam逐一分析比较目标酶蛋白的理化性质，所得结果如表1所示。

表1 不同植物Hqt的序列号及理化性质

分析结果表明，10种不同植物的Hqt约含400～500 个氨基酸残基；相对分子质量约为47.0～50.0 kDa。等电点(pI)变化分布在5.48～7.64之间，总体为中性偏酸分布。分析结果表明不同植物Hqt稳定性有差异，金银花、桔梗、刺苞菜蓟中的该酶稳定性相对较强，其他6种植物该酶稳定性较弱。相对平均亲水性分析表明该酶为亲水性蛋白，只有在虎眼万年青中该酶表现为疏水。

3.1.2 羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸/莽草酸 羟基肉桂
酰转移酶(Hct)

下载了10 种植物Hct氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在线软件分析比较目标酶蛋白理化性质，所得结果如表2所示。

表2 不同植物Hct的序列号及理化性质

分析结果表明，10种不同植物的Hct约含400～500 个氨基酸残基；相对分子质量约为44.0～50.0 kDa。等电点(pI)变化分布为5.44～6.76，皆为等电点弱偏酸性分子。不同植物Hct稳定性也存在差异，金银花、烟草、桔梗、团花树、紫锥菊、木槿中该酶稳定性相对较强，其他4种植物该酶稳定性较弱。所有10种植物的Hct均为亲水性蛋白。

3.1.3 P-香豆酸3-羟化酶(C3h)

下载了10种植物C3h氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在线软件分析比较了目标酶蛋白理化性质，所得结果如表3所示。

表3 不同植物的C3h的序列号及理化性质

分析结果表明，10 种不同植物的C3h约含400～500 个氨基酸残基，相对分子质量约为44.0～60.0 kDa。等电点(pI)方面，金银花C3h较为特殊，为碱性较强的8.92，其他9种C3h分子等电点均为弱酸性值，分布在5.42～6.76之间。金银花、芝麻、西桦、苦荞、水仙、毛白杨C3h分子较为稳定，其他4种植物的该分子稳定性较弱。所有10种植物的C3h皆为亲水性蛋白。

3.2 系统发生分析

3.2.1 羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸 羟基肉桂酰转移酶(Hqt)

本研究利用MEGA-7软件对表1中所列不同植物的Hqt氨基酸序列进行比对，利用距离标尺、分支长度、自展值等指标分析了Hqt分子的进化关系，并构建了系统发生树(图1)。由图1可知，金银花与桔梗的Hqt亲缘关系最近，其次是刺苞菜蓟，三者的分支长度接近，遗传距离相近，这与它们的稳定性分析结果也较为吻合，可能表明它们在绿原酸的生物合成途径中的作用相似度更高。系统发生树还显示虎眼万年青Hqt与其余9种植物Hqt亲缘关系较远，这一结果与亲水性分析结果吻合，可能提示虎眼万年青中的Hqt的结构、功能及其参与的主要代谢途径等方面与其他9种植物存在差异。

图1 10种植物Hqt的亲缘分析

3.2.2 羟基肉桂酰辅酶A:奎宁酸/莽草酸 羟基肉桂
酰转移酶(Hct)

利用MEGA-7软件对表2中10种植物的Hct氨基酸序列进行比对分析，构建系统发生树。由图2可知，金银花与烟草的Hct亲缘关系较为接近，表明它们在绿原酸合成途径中作用可能相近，因此研究该代谢途径时可以对金银花和烟草进行比较[26]。

图2 10种植物Hct的亲缘分析

3.2.3 P-香豆酸3-羟化酶(C3h)

利用MEGA-7软件对表3中10种植物的C3h氨基酸序列进行比对分析，构建系统发生树。如图3所示，金银花C3h和其他9种植物间没有亲缘关系特别相近的分子。相对而言，它和金合欢、豇豆、毛白杨、西桦的亲缘关系可能稍近一些。其他植物中金合欢和豇豆亲缘关系较近，毛白杨和西桦的亲缘关系较近。

图3 10种植物C3h的亲缘分析

4 结论

不同植物绿原酸合成途径3种关键酶的理化性质分析结果表明，从氨基酸残基数目、相对分子质量、等电点、稳定性、亲水性等几个基础指标来看，不同生物中的同种酶相似性较高，但是具体细节方面会有一些差异。对Hqt而言，10种植物中金银花与桔梗、刺苞菜蓟的Hqt分子稳定性较高，而虎眼万年青的Hqt与其他植物有着较为明显的差异。在Hct方面，不同植物的酶分子只在稳定性方面存在一些差异。在C3h方面，金银花C3h的等电点为碱性达8.92，而其他植物皆为弱酸性。氨基酸序列比较和建树分析表明，不同植物同类酶的理化性和序列相似性分析结果是一致的。以金银花为例：Hqt方面，金银花和桔梗进化关系最近，其次是刺苞菜蓟；与虎眼万年青遗传距离最远。Hct方面，与金银花进化关系最近的是烟草，其次是团花树和中粒咖啡。C3h方面，则没有发现与金银花进化关系特别接近的植物物种。

5 讨论

对金银花等不同植物绿原酸合成途径中Hqt、Hct、C3h的系统发生分析表明，用不同蛋白质分子建立系统发育树不能得出各种植物相同的进化关系。如：金银花和桔梗的Hqt分子进化关系较近，而它们的Hct的进化关系则较远。代谢途径相似的情况下，不同植物中合成的终产物(如：绿原酸)含量也可能有差异。因此关键酶的序列差异和表达差异都可能对代谢终产物的生成有所影响。不同植物不同酶分子进化上的差异，可能表明它们所在植物为了适应各自的环境和生存策略，选择了对不同化合物的需求差异，并进一步将这种差异反映在了代谢途径中，最终这种选择会映射到相应的基因组中，影响到遗传的变化。虎眼万年青Hqt与其他植物较大的遗传距离以及疏水性方面的明显差异，可能表明绿原酸合成途径对该植物而言，或者有不一样的作用。另外，金银花C3h与其他植物同一分子在等电点方面的显著差异，可能指示金银花细胞中C3h的活性环境与其他植物或有差异，但这需要通过实验进一步证明。

本研究最大的遗憾是在选择植物种类的时候，没有选择相同物种的3种关键酶进行比较，削弱了不同植物绿原酸合成途径的可比性。这主要是因为并非所有目的物种的Hqt、Hct和C3h都被测序研究，或者并非所有的植物都有完整的绿原酸合成途径。因此，如果要有更准确的分析结果，可能还需要进一步改进研究策略，例如：3种绿原酸合成途径的关键酶在金银花和烟草中都存在，且两种植物的Hct的分子遗传距离很近。因此在后续代谢途径比较研究过程中可以将金银花和烟草进行对比，帮助人们进一步了解了绿原酸合成途径的细节。