吡非尼酮通过抑制TGF-β1 通路和炎症反应预防大鼠尿道损伤后的纤维化及狭窄

尿道狭窄是泌尿外科常见的男性尿道疾病，作为最大的发展中国家，我国尿道狭窄的发生率显著高于其他国家，且由于该病具有高复发率特点，反复多次手术显著增加了患者的身心以及经济负担。尿道狭窄的病因包括外伤性、医源性以及慢性炎症等。其中，创伤是最常见的因素，部位以球部尿道居多，约占50%以上。近年来，随着尿道本身和经尿道手术方式的广泛应用，医源性损伤导致的尿道狭窄患者数量显著增加。然而，任何部位的尿道狭窄，无论其致伤原因或损伤程度如何，在创伤愈合过程中，均可能伴随纤维化过程，导致瘢痕形成，最终发生尿道狭窄。国内外学者一直探索如何减少损伤后尿道狭窄的方法，不断改进手术方式，但仍未有效降低术后狭窄的发生率。如何减少尿道狭窄的发生率及狭窄程度已成为下尿路重建领域的研究重点。吡非尼酮是目前获批用于特发性肺纤维化治疗的广谱抗纤维化小分子药物，但是否能够缓解尿道狭窄的发生尚不清楚，鉴于过度纤维化导致瘢痕狭窄的理论基础，本研究探讨吡非尼酮对于大鼠尿道损伤后狭窄形成的预防作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

自中国科学院上海实验动物中心购买SD雄性大鼠30 只，8～10 周龄，体质量250～300 g，饲养室温20～24 ℃，12 h昼夜交替，自由饮食。饲养1周后随机分为3组（10只/组）。阴性对照组：大鼠不予尿道损伤处理，腹腔注射与吡非尼酮组等量的溶剂；阳性对照组：大鼠尿道损伤，腹腔注射与吡非尼酮组等量的溶剂；吡非尼酮组：建立大鼠尿道损伤模型后，按100 mg·kg·d腹腔注射吡非尼酮。记录所有大鼠生活状态和体质量变化，尿道损伤模型建立当日记为第0天，术后第14天行逆行尿道造影、留取尿道损伤组织并处死大鼠。实验遵循国家实验动物管理保护条例，通过蚌埠医学院实验动物伦理审批（伦动科批字[2021]第070号）。

1.2 尿道损伤模型的建立

10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，将大鼠仰卧固定于操作台，剔除尿道周围皮肤毛发，显露尿道外口，碘伏局部消毒。组织剪自尿道外口向根部将阴茎包皮在腹侧纵行剪开，轻轻提起阴茎，分离包皮及周围组织。用24G静脉留置针去除针芯后经尿道外口置入尿道，在留置针引导下用刀片纵行切开后尿道海绵体及尿道，长约0.5 cm。4-0可吸收线缝合尿道海绵体及皮肤组织。

1.3 逆行尿道造影

大鼠麻醉成功后，固定于数字胃肠机检查床上。实验人员穿好防护服，经尿道外口将24G去针芯静脉留置针置于前尿道。在X线实时观察下一手固定尿道和留置针管，一手经留置针管向膀胱内缓慢推入造影剂碘伏醇注射液，当尿道和膀胱显影后X线摄片，通过显影观察整个尿道腔的狭窄情况。

1.4 组织病理学染色及评分

手术后第14天逆行尿道造影结束后通过过量麻醉处死大鼠，迅速用组织剪剪开阴茎包皮，剥离尿道周围组织，找到并切除损伤尿道组织，阴性对照组直接剪取正常后尿道组织。多聚甲醛固定尿道组织、石蜡包埋、切片。H&E染色观察组织形态，Masson染色检测胶原纤维数量，免疫组织化学染色及Western blot检测组织a-SMA 和TGF-β1 的蛋白表达。Masson 染色采 用Image J 软件进行半定量分析蓝染区域占比；western blot结果根据条带的灰度值进行统计学分析；免疫组织化学染色结果由2位经验丰富的病理科人员进行半定量分析，评分根据5个不同部位高倍视野的阳性细胞数百分比和染色强度进行。阳性细胞数百分比：＜5%为0分，5%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。总分为两者相乘所得，为0～12分。

当时，灌着石油的内燃机在战争中又开辟了一个崭新的领域，空中打击战。1914年第一次世界大战爆发时，航空工业初见雏形，仅有1000人；而5个月后的1915年1月，英国也才制造出250架飞机，其中60架还属试产机型。为了迎合战争需要，飞机立即被应用于军事领域。

为探讨吡非尼酮抑制尿道损伤后狭窄形成的可能机制，分别通过免疫组织化学染色（图6A～D）和Western blot检测（图6E、G）与纤维化密切相关的TGF-β1蛋白表达水平。结果发现，吡非尼酮组尿道周围组织中TGF-β1表达低于阳性对照组（＜0.05，＜0.01），吡非尼酮可能通过抑制TGF-β1的表达抑制组织纤维化过程。

1.5 qRT-PCR检测组织TNF-α、IL-6、IL-1β的基因表达

计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析，两组间计量资料采用检验比较，＜0.05为差异有统计学意义。

为了验证吡非尼酮对炎症相关因子的影响，运用qRT-PCR技术检测TNF-a、IL-6、IL-1β 的mRNA表达量（图7）。结果表明阳性对照组尿道组织炎症相关因子的基因表达显著增高（＜0.01），而吡非尼酮组的表达量显著低于阳性对照组（＜0.05），与阴性对照组无显著不同。

1.6 统计学分析

使用TRIzol提取阴性对照组、阳性对照组和吡非尼酮组尿道海绵体组织的总RNA，以各组总RNA为模板，用Takara逆转录试剂盒行逆转录反应合成cDNA第一链，利用SYBR Premix Ex TaqII试剂盒在反应体系（20 μL）下进行荧光定量PCR。每个样品以GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量（2）法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。

体育小镇投资门槛较高，对于一般企业来说没有相应的经济能力来承担建设费用，所以小镇的投资者多为产业龙头企业，如万科建造的冰雪小镇、恒大建造的足球小镇等。面对这样的市场环境状况，培育多元市场主体、优化资源配置是在全国范围内建造体育小镇的关键所在。

2 结果

2.1 大鼠术后情况

术后14 d通过逆行尿道造影和H&E染色观察3组大鼠尿道狭窄程度。结果显示，所有存活大鼠均成功形成尿道狭窄。逆行尿道造影可见阳性对照组尿道较阴性对照组正常尿道管腔明显变细，吡非尼酮组大鼠尿道较阳性对照组大鼠好转（图3）。HE染色进一步证实阳性对照组尿道上皮细胞增生明显，管腔显著狭窄，周围组织炎性细胞增多，细胞排列紊乱。吡非尼酮组尿道管腔较对照组变大，伴轻度上皮细胞增生，管周组织仅见少许炎细胞浸润，细胞排列尚规则（图4）。

2.2 吡非尼酮对大鼠尿道损伤后狭窄形成的影响

阳性对照组和吡非尼酮组大鼠均成功构建尿道损伤模型，阳性对照组大鼠于术后第3天死亡1只，考虑尿道梗阻导致死亡，吡非尼酮组大鼠术后第7天死亡1只，考虑感染引起，其余大鼠均未死亡，术后14 d尿道外口皮肤切口已完全愈合（图1）。阳性对照组和阴性对照组大鼠体质量增长情况无明显差异，吡非尼酮组大鼠术后体质量增长速度低于其他2组，尤其在术后10 d以后更加明显（＜0.05，图2）。

2.3 吡非尼酮对胶原表达的影响

尿道损伤后瘢痕狭窄是常见的尿道疾病，但因术后易复发的特点，使其成为棘手的临床问题。如何减少术后组织纤维化是预防狭窄的关键性问题。近年来，药物应用在预防尿道狭窄方面的探索逐渐增加。许宁等通过从尿道疤痕组织中提取成纤维细胞探讨法舒地尔对瘢痕形成的影响和机制，结果发现法舒地尔通过Rho/ROCK通路抑制成纤维细胞增殖、迁移和胶原蛋白合成功能，从而减少尿道损伤后狭窄的发生。mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制成纤维细胞增生和胶原蛋白表达，作用可能与mTORC1/4E-BP1 和TGF-β/Smad 信号通路相关。Sangkum等通过TGF-β1注射诱导的尿道纤维化模型发现局部注射脂肪组织衍生干细胞（ADSCs）的尿道纤维化大鼠尿道组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达明显减少，表明局部注射ADSC有可能成为预防尿道疤痕形成及提高尿道狭窄治疗成功率的辅助治疗手段。除此之外，刘晓鹤及其团队初步证明A型肉毒杆菌毒素（BTX-A)对预防兔前尿道急性热损伤后的狭窄有显著效果，以上研究为临床药物预防和治疗尿道狭窄提供了依据。本研究探讨了抗纤维化药物吡非尼酮对尿道损伤后狭窄形成的影响，结果发现吡非尼酮可有效抑制尿道损伤后的纤维化，可能成为预防尿道狭窄的选择药物。

2.4 吡非尼酮对TGF-β1表达的影响

1、灌溉渠道监测。监测结果显示：江华水库周边为林地分布，沟渠分布较少，灌区的宁远县内耕地分布较多的地方沟渠分布较多，道县、江永的耕地区有部分沟渠分布。由于扩建后监测采用的影像为2017年度9-11月，灌区的渠道建设工程到监测时间还未全部完成，本监测仅提取了影像上可明显识别的灌溉渠道进行分析。根据灌区规划数据统计，工程将新建干渠以上渠道240公里、支渠170公里，扩建后的灌区将成为湖南省最大的灌区，扩建最大的效益就是灌溉效益。

2.5 吡非尼酮对TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达的影响

在MLAA-22酶切位点分析结果提示：MLAA-22存在大量的Proteinase K的酶切位点，蛋白激酶催化蛋白质磷酸化从而改变其活性，蛋白激酶是细胞信号通道中起化学修饰作用的成员，参与多种细胞功能诸如

3 讨论

在各组尿道组织H&E染色观察组织形态（图5A～C）基础上，进一步通过Masson染色观察尿道周围组织胶原纤维数量（图5D～F、J）以及通过免疫组织化学染色检测组织中a-SMA的表达（图5G～I、K）。结果显示，阳性对照组大鼠尿道海绵体组织内可见明显蓝染的胶原纤维增生，而吡非尼酮组胶原纤维含量较少，胶原排列较阳性对照组更加规则有序。同时，免疫组织化学染色发现阳性对照组a-SMA表达显著高于阴性对照组和吡非尼酮组（＜0.05，＜0.01）。除此之外，Western blot结果与免疫组化一致（图6E～F）。

至今为止，尿道损伤狭窄模型的建立较为多样但并无统一方法。陈琦等应用F10小儿电切镜配合2 mm环形电极于尿道5～7点处切除2 mm×3 mm的全层尿道建立犬尿道狭窄模型，术后1月所有动物尿道损伤部位均显示瘢痕组织形成。与此相似，国内外专家应用外科电刀和导丝制作电极电凝灼烧尿道建立损伤狭窄模型。另外，一些研究团队通过尿道内或尿道外植入并引爆自制爆炸装置模拟尿道球部创伤后尿道狭窄模型。除此之外，可以通过简单切开缝合尿道的方式模拟尿道损伤后狭窄。对于狭窄模型建立成功的鉴定，多采用尿道造影或彩超及尿道镜等评估尿道内径，同时通过Masson及a-SMA染色等病理学检测组织胶原沉积状态。本研究基于尿道周围海绵体纤维化是尿道狭窄形成的重要原因这一理论基础，实验中并未直接切开尿道，而在静脉留置针针管作为尿管引导下，纵行切开并缝合尿道海绵体建立尿道狭窄，该方法可无需留置导尿管，减少操作，降低模型建立的难度，通过尿道造影和组织病理学证实该方法可建立损伤后狭窄，可作为有效的方法推广应用。

吡非尼酮是一种抗纤维化药物，因可有效抑制肝和肺等组织纤维化，已被FDA批准的用于治疗特发性肺纤维化（IPF）。除可缓解肺纤维化外，研究表明吡非尼酮局部治疗可有效减轻青光眼排水装置植入后纤维化，近期研究发现吡非尼酮可显著降低兔耳瘢痕增生指数，减少瘢痕高度，促进胶原组织有序排列，表明可抑制瘢痕的形成。然而，吡非尼酮防治组织纤维化的机制并未明确。Jin等研究表明吡非尼酮主要通过抑制TGF-β1和CTHRC1缓解成纤维细胞活性，减少胶原沉积和肺纤维化。另有研究发现吡非尼酮可抑制损伤后的炎症反应，从而抑制后续的纤维化过程。Medina等观察吡非尼酮软膏对深度烧伤小鼠创面炎症反应和纤维化的影响，结果发现可显著减少创面愈合过程中性粒细胞数量及抑制相关炎性细胞因子的表达，同时减少a-SMA表达。此外，研究显示吡非尼酮也可抑制间质性肺炎和IPF患者肺泡巨噬细胞细胞因子的表达。在本研究中，我们通过Masson染色和a-SMA检测证明吡非尼酮可缓解尿道组织纤维化和胶原沉积，western blot发现吡非尼酮抑制损伤组织a-SMA和TGF-β1表达，同时qRT-PCR 检测了吡非尼酮能够抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达。这些结果为吡非尼酮在预防尿道损伤后狭窄及作用机制的研究提供了依据。

目前研究尚未明确吡非尼酮抑制纤维化的具体分子机制，但大多认为TGF-β1可能是吡非尼酮作用的关键分子，而TGF-β1已被证实是组织纤维化重要的驱动因子，能够诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，后者能够分泌a-SMA，参与细胞外基质的收缩与重塑，进而促进纤维化的发展。本研究结果发现吡非尼酮抑制了组织TGF-β1表达，这可能是抑制纤维化的潜在机制之一。同时，研究发现吡非尼酮组大鼠尿道组织炎性细胞数量明显减少，说明吡非尼酮可缓解炎症反应，这也可能参与了纤维化抑制作用。本研究尚存在一些不足，在应用吡非尼酮的过程中，发现药物对于大鼠体质量存在影响，具体机制需要进一步研究明确。同时，本研究并未检测吡非尼酮对于中性粒细胞和巨噬细胞的影响，后续实验将进行深入探讨。

3)L=7 m时，射流到达工作面端头发生偏转时的速度较小，涡流强度较小，涡流区域进一步扩大，但是其核心区域却在减小，回旋风量较大偏转角度也进一步扩大，回风流缓慢向风筒侧巷壁运移。

综上所述，本研究首次证实吡非尼酮对尿道损伤后纤维化及狭窄的预防作用，并阐述可能与吡非尼酮抑制TGF-β1通路和炎症反应相关，结果提示吡非尼酮可能成为预防尿道狭窄新的药物选择，具有重要的临床应用价值和意义。