Bax抑制因子1通过促进视神经萎缩蛋白1表达抑制小鼠动脉血管钙化

Bax抑制因子1（BI-1）是重要的细胞凋亡抑制因子。本课题组前期研究发现BI-1与血管钙化密切相关，血管钙化中，BI-1蛋白表达下降，细胞钙含量、碱性磷酸酶活性、Runt相关转录因子2（Runx-2）、细胞凋亡增加；过表达BI-1蛋白后细胞钙含量、碱性磷酸酶活性、Runx-2、细胞凋亡减少，血管钙化减轻。但BI-1通路的下游调控蛋白并未清楚。视神经萎缩蛋白1（OPA1）作为介导线粒体内膜融合的主要因子，在维持线粒体结构和功能稳态中发挥重要作用。前期研究结果显示血管钙化下调OPA1蛋白表达，线粒体融合减少，线粒体损伤增加，钙沉积、Runx-2蛋白表达、细胞凋亡率增加，而过表达OPA1能促进线粒体融合，抑制钙沉积、细胞骨型分化和凋亡，减轻血管钙化。

此外，哈尔滨工业大学的高波和金明生等分别于2005年和2009年提出了利用气囊进行抛光的力控末端执行器，如图12所示。工作时，通过对气囊压力进行实时调节，可改变或保持橡胶气囊与模具表面的接触力和接触区的压力分布。该装置具有柔性好、与工件接触充分和适用范围广等优点[16-22]。

BI-1 是线粒体形态和功能的重要调节蛋白。BI-1能调控心肌微血管内皮细胞线粒体融合－分裂，保护线粒体结构和功能，减少氧化应激损伤和细胞凋亡。在急性肾损伤中，肾小管上皮细胞BI-1表达下调，线粒体分裂增加；上调BI-1表达后，线粒体分裂减少，氧化应激损伤和细胞凋亡减轻。但BI-1蛋白是否直接影响OPA1蛋白表达？BI-1是否通过OPA1抑制钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，进而减轻血管钙化，这些问题尚未见研究。因此，本研究构建小鼠血管钙化模型，并探究BI-1如何通过调控OPA1蛋白影响血管钙化。

1 材料和方法

1.1 材料

ApoE小鼠、BI-1；ApoE小鼠、BI-1；OPA1；ApoE小鼠（北京赛业生物公司）。动物实验规程已获批准，符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

HE染色试剂盒（北京索莱宝公司）；von Kossa染色试剂盒（北京索莱宝公司）；TUNEL试剂盒（罗氏）；钙含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BI-1、OPA1、Runx-2、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和β-肌动蛋白（β-actin，Abcam）。SDS-PAGE凝胶电泳仪（Bio-Rad）、光学显微镜（奥林巴斯）。

1.2 转基因小鼠的构建方法

应用SPSS19.0软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较作独立样本检验，计数资料以百分数表示，组间比较采用χ检验。＜0.05为差异有统计学意义。

取主动脉组织制备匀浆，加入细胞裂解液裂解30 min，BCA法检测蛋白浓度，经上样、电泳、电转、封闭后，加入一抗（BI-1 抗体、OPA1 抗体、Runx-2 抗体、BMP-2抗体、活化的caspase-3抗体均按1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜后使用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000）室温孵育2 h。冲洗后，暗室曝光，扫描条带。使用Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参。

由于政府对土地使用权的划分相互交织，政府的土地使用权年龄不合理，不仅限制农民自身的发展，影响农村发展，也制约了城镇化的发展。在我国，施行的农民土地承包制的使用年限比较短，使村民在土地上的生产经营活动没法进行长远有效的规划，这也限制了中国农村土地的健康发展。根据国家有关部门颁布的政策，限制土地的合同管理权和宅基地使用权的转让也是非常明确的，因此农民也没法充分利用土地来提升自己的经济水平。农民自身来讲，也不能充分利用土地的流转进行资金流动，阻碍了我国城镇化的发展[3]。

1.3 小鼠钙化模型的建立和分组

8周ApoE小鼠，禁食不禁水12 h后，于腹腔内注射链脲佐菌素（50 mg/kg），1次/d，连续5 d。如连续2 d测量血糖≥250 mg/dL，则认为糖尿病小鼠模型成功。高糖高脂饲料喂养12周后，开始腹腔注射N-（1-羧甲基）-L-赖氨酸促进斑块钙化，注射剂量为60 μg/次，连续注射16周，取其主动脉弓用于实验。实验分为4组（=6）：Control组（ApoE小鼠普通饲料喂养），VC组（ApoE小鼠建立钙化模型），VC+BI-1组（BI-1；ApoE小鼠建立钙化模型）和VC+BI-1+OPA1组（BI-1；OPA1；ApoE小鼠建立钙化模型）。

1.4 小鼠主动脉血管平滑肌细胞培养和钙化模型的建立

无菌条件下取出C57BL/6、BI-1或者BI-1；OPA1小鼠主动脉，剪成小组织块，置于培养皿底部，37 ℃培养箱中培养，等到细胞达到80%融合的时候即可传代用于试验。经α-SMA免疫组织化学染色鉴定纯度＞95%。

血管平滑细细胞长至融合状态后用于实验，在常规培养基（10%DEME细胞培养液）中加入10 mmol/L β磷酸甘油（β-GP）和7.2 mmol/L 氯化钙，每隔2 d换1次液体，连续培养14 d，建立血管平滑肌细胞钙化模型。

1.5 小鼠血清血脂、血糖检测

小鼠摘取眼球取血，4 ℃下3000 r/min离心10 min，取上清液，使用BECKMAN COULTER Au2700全自动生物化学仪分析血糖、血甘油三酯、血胆固醇水平。

要实现信息化的会计教学就必须重视采用实践性教学方法，会计是一门实践性极强的学科，除了理论教学之外，必须十分注重实践化教学，让理论与实践结合起来。例如多让学生进行上机训练，多进行实习锻炼，这样才能将会计理论应用到实际工作中去。但是在会计教学过程中往往忽略了实践教学，未能很好地将理论教学与实践教学结合，学校未能较好地与企业合作，形成一些长期稳定的实践基地，同时也未能较好地组织学生进行实践活动，实习活动往往都流于形式。这样的教学模式势必会造成学生与实际脱钩，无法满足市场和企业的需求，这对于培养合格的会计信息化人才来说存在较大的难度。所以学校一定要提高会计教学的实践意识。

1.6 HE染色和von Kossa染色

HE染色：小鼠主动脉弓经4%多聚甲醛固定后，然后进行包埋、切片、脱蜡、脱水、HE染色处理，于普通光学显微镜下拍照记录。von Kossa染色：组织石蜡切片经脱蜡、脱水后，置于硝酸盐溶液中照射30 min进行染色，蒸馏水清洗3次后，使用硫代硫酸钠溶液定影和中性品红复染，蒸馏水再次冲洗后于显微镜下观察钙盐沉积情况，使用Image-Pro Plus分析钙盐沉积面积百分比。

1.7 免疫组织化学染色检测Runx-2和BMP-2表达量

《标准化法》第25条的禁止性规定，联结第26条的出口产品与服务的豁免规定，可以从解释学上发现，对于不符合强制性标准的产品而言，不得生产与销售二者之间，是一组并列的不可拆分的联合适用条件，而进口或提供二者之间，则是可拆分的选择适用的关系。这也是本文的一个微细的发现。

取组织石蜡切片，柠檬酸缓冲液中修复后，BSA封闭液封闭，然后滴加一抗抗体Runx-2（1∶300）或BMP-2（1∶300），4 ℃孵育过夜，蒸馏水冲洗3次，然后滴加二抗抗体，37 ℃孵育1 h，蒸馏水冲洗3次，滴加DAB显色，然后复染、脱水、封片，在显微镜下观察并拍照。每张切片取5个高倍镜视野，计算Runx-2或BMP-2阳性面积百分率。

1.8 主动脉组织钙含量的测定

金华寺汤溪镇寺平古村主要的保护模式为划归为文物，售票观览。单一的盈利方式导致未来面临的困境是可以预见的，如何打开瓶颈投入活化更新项目，促进传统村落可持续发展是值得思考的问题。但还要防止进入另外一个误区，即在中国的许多传统村落，由沿街商铺的商户构成的多以游客市场筛过“经得起市场检验”的特色小食、区域特产、文艺小铺以及饰品首饰为主流的产业［1］。这些所谓的“主流”没有地域特色，很难成长为支撑传统村落持续发展的产业。

要借助互联网的优点，把电视台节目的传播做到最大化，全面提高节目的传播度，使节目的受众群体不再是电视机前的用户，更要让互联网用户也能够及时获取电视节目中的信息，从而提高电视节目的影响力，扩宽受众群体。要加快节目的更新换代，发挥优势，打造节目品牌，立足眼前，放眼社会现象，结合当代形式，结合各个社交平台，例如微博、豆瓣、知乎等新媒体，在其中寻找大众接受并喜爱的节目题材，不能一味地选择抄袭优秀节目，获取流量，要做有想法、有创新、有责任感的新节目，为大众带来优良的电视节目的同时传播正确的价值观与人生观。?

1.9 TUNEL法检测血管平滑肌细胞凋亡情况

小鼠血管钙化时，BI-1和OPA1蛋白表达均下降，差异有统计学意义（=0.0044）。而过表达BI-1蛋白促进OPA1蛋白表达（=0.0142，图1）。为进一步验证BI-1和OPA1的相互作用关系，我们建立了血管平滑肌细胞钙化模型，结果显示β-GP和氯化钙能降低血管平滑肌细胞BI-1和OPA1蛋白，而上调BI-1蛋白能增加OPA1蛋白表达（图2）。

1.10 Western blot法检测主动脉组织BI-1、OPA1蛋白的表达水平

将平滑肌特异性表达Cre 酶的转基因雄性小鼠（Tagln-cre）与雌性OPA1小鼠交配，通过繁殖筛选，得到Tagln-cre；OPA1转基因小鼠，并与BI-1；ApoE小鼠交配繁殖，并筛选出BI-1；OPA1；ApoE转基因小鼠，通过Western blot鉴定OPA1敲低的程度与特异性。

1.11 统计学方法

构建血管平滑肌特异性蛋白SM22α启动子与BI-1位点突变体真核表达质粒，通过显微注射受精卵的方法制备目标小鼠，经过Western blot法证明BI-1在小鼠血管平滑肌细胞特异性高表达。将BI-1转基因小鼠与ApoE小鼠多次杂交并做基因鉴定之后，得到基因型为BI-1；ApoE小鼠用于试验。

取主动脉组织放入盐酸中过夜，次日取上清液进行钙含量测定，使用酶标仪检测吸光度，计算出钙含量（mg/g）。

2 结果

2.1 小鼠体质量、血糖、血脂比较

与Control 组比较，VC 组、VC+BI-1组和VC+BI-1+OPA1组体质量、血糖、血胆固醇、血甘油三酯均升高（＜0.001）。与VC组比较，VC+BI-1组和VC+BI-1+OPA1组体质量、血糖、血胆固醇、血甘油三酯差异无统计学意义（＞0.05，表1）。

2.2 小鼠血管钙化后BI-1和OPA1的蛋白表达

取血管平滑肌细胞建立钙化模型，使用多聚甲醛固定细胞，使用TUNEL试剂盒测定细胞凋亡，每样本中加入50 μL 标记液，常温下培养60 min，然后加入辣根过氧化物培育30 min，PBS冲洗后，加入显色剂，细胞核染成棕色提示细胞凋亡，显微镜下计数并记录。

这笔专用基金的宣传面临着一个棘手的问题。在治疗阿尔茨海默病方面，唯一通过审批的药物不能阻止神经退行性疾病的发展，只能治疗该病的症状，而且治疗效果也不太好。在过去一年中，基于该领域一些假设（如降低遍布于阿尔茨海默病患者大脑的β-淀粉样斑块水平将会阻止该病的发展等）的几项主要的临床试验都失败了。最近，一种靶向攻击β-淀粉样斑块的抗体在第二阶段试验中呈现出较好的结果。然而，鉴于过去那些受到密切关注的化合物所遭到的失败，许多研究人员仍然对此持有怀疑态度，并希望看到更大规模的第三阶段试验。

2.3 BI-1/OPA1蛋白通路对小鼠血管钙化钙沉积和斑块面积的影响

von Kossa染色结果显示，血管钙化后钙盐沉积明显增多，过表达BI-1蛋白后钙盐沉积减少（=0.0006），沉默OPA1蛋白后钙盐沉积再次增加（=0.0007，图3）。过表达BI-1蛋白不仅能减少钙化面积，还能减少斑块面积，而沉默OPA1 蛋白后斑块面积增多（=0.0013，图4）。血管钙化后钙含量增加，过表达BI-1蛋白能降低钙含量，而沉默OPA1蛋白后钙含量再次增高（＜0.001，图5）。

2.4 BI-1/OPA1 蛋白通路对小鼠血管钙化Runx-2 和BMP-2表达的影响

免疫组织化学和Western blot结果显示，血管钙化后Runx-2 和BMP-2 表达增加，过表达BI-1 蛋白后Runx-2和BMP-2表达下降，而沉默OPA1蛋白后Runx-2（=0.0008）和BMP-2 表达恢复到钙化时水平（=0.0045，图6～8）。

2.5 BI-1/OPA1 蛋白通路对小鼠血管钙化活化的caspase-3表达的影响

血管钙化后活化的caspase-3表达增加，过表达BI-1蛋白后活化的caspase-3蛋白表达减少；而沉默OPA1蛋白后活化的caspase-3 蛋白表达再次增多（=0.0054，图9）。为进一步证实BI-1/OPA1蛋白通路对细胞凋亡的作用，我们建立了血管平滑肌细胞钙化模型，结果显示过表达BI-1蛋白明显抑制血管平滑肌细胞凋亡，而沉默OPA1 蛋白后细胞凋亡又恢复到钙化时水平（=0.0002，图10）。

3 讨论

血管钙化在糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病中非常常见，是心血管急症的重要危险因子。血管钙化分为两类：一类是发生在内膜的动脉粥样硬化钙化，另一类是发生在中膜的慢行肾脏疾病或者糖尿病肾病的钙化。血管钙化的机制十分复杂，目前认为多种信号转导途径调节的主动过程，类似于骨发育过程。其机制学说主要包括：血管平滑肌细胞成骨型分化学说、钙或磷酸盐稳态失常、细胞凋亡、炎症等。有学者提出BI-1在冠状动脉粥样硬化心脏病中发挥一定作用，BI-1可以抑制心肌微血管内皮细胞凋亡和结构破坏，进而减轻缺血再灌注引起的心脏损伤。有研究结果提示过表达BI-1能减少心肾综合征引起的心肌细胞凋亡和心脏的损害。最近研究表明BI-1是抗血管平滑肌细胞钙化的关键分子。本研究通过构建小鼠血管钙化模型，发现血管钙化后，BI-1蛋白表达明显下降，血管组织钙含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表达增加，而过表达BI-1蛋白能降低细胞钙含量、Runx-2、BMP-2和活化的caspase-3蛋白表达，进而减轻血管钙化。本研究从动物试验方面进一步证实了BI-1通过抑制细胞凋亡和细胞骨型分化发挥对血管的保护作用。

血管钙化时，激活线粒体融合/自噬能起到减轻血管钙化的作用。前期研究发现，血管钙化时，OPA1表达减少，而促进OPA1表达能减少线粒体分裂，促进线粒体融合和自噬，保护线粒体结构和功能完整，减少氧化应激损伤等，进而减轻血管钙化。有研究发现BI-1能保护肾小管上皮细胞线粒体结构完整，减少线粒体氧化应激，促进线粒体呼吸功能，抑制线粒体分裂和线粒体凋亡，进而减轻急性肾损伤。有研究发现BI-1蛋白能抑制心肌缺血再灌注损伤时线粒体膜通透性转换孔的开放，减少线粒体分裂和线粒体损伤引起的细胞凋亡。但是血管钙化时BI-1是如何调控线粒体融合蛋白OPA1的，BI-1是否通过OPA1影响血管钙化，还有待于进一步明确。本研究结果发现，血管钙化后BI-1失活抑制OPA1蛋白表达，过表达BI-1蛋白后OPA1蛋白表达增加，结果提示BI-1可以调控OPA1的表达。另外我们进一步发现过表达BI-1能抑制钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，而基因敲除OPA1蛋白后，钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡指标增加，血管钙化加重。

综上所述，本研究首次探讨BI-1/OPA1通路和血管钙化的关系，并进一步验证了BI-1对OPA1的调控关系，结果提示血管钙化可以抑制BI-1，减少OPA1表达；而促进BI-1蛋白表达，能激活OPA1表达，减轻血管钙化。相信随着研究的深入，将来一定为血管钙化诊断和治疗开辟新的方法和途径。本研究局限性在于缺乏更深入的机制研究，比如内质网应激、线粒体自噬等；另外缺乏BI-1；ApoE小鼠组、BI-1；OPA1；ApoE小鼠组作为对照，有待进一步研究。