杂草抗药性分子机制研究进展

项青

（芜湖职业技术学院园林园艺学院，安徽 芜湖 241003）

0 引言

杂草与人类生活息息相关，其影响最大的方面就是农业生产。虽然农业生产中植物病原物、农业害虫和农田杂草均会给作物的产量和质量造成巨大的损失，但其中以杂草造成的损失最大，可以造成34%的产量损失[1]。杂草主要通过与农作物竞争水分、肥料、生存空间和的阳光等，影响作物的正常生长发育，从而影响作物的产量和质量。除此之外，一些杂草还会作为病原物的载体，传播病原。因此，防治杂草是保障粮食产量的重要方式。在化学除草剂出现之前，主要是通过物理防治，在田间人工拔除杂草。20 世纪30 年代，化学除草剂被用于防治杂草，最初除草剂能够很好地对杂草进行防治，但是随着大量、长期、频繁地使用，杂草逐渐对现有的除草剂均产生了抗性[2]。由于杂草和作物之间高度的相似性，因此目前大部分的除草剂都为选择性的除草剂。杂草对选择性除草剂的抗性发展较广谱的除草剂更快。目前，杂草已经对几乎所有类型的除草剂均产生了抗性。杂草抗药性的产生导致除草剂的防效降低。为保证粮食产量，就需要使用更加大剂量的除草剂，这又会加剧抗药性的发展，形成一个恶性循环，最终会导致无药可用的后果。除此之外，大剂量除草剂的使用还会导致环境的污染，危害人类的生命健康。因此，对抗药性的研究和治理十分紧迫[3]。

杂草抗药性的发展是以种群为单位，建立在带有耐药基因型的个体在种群内不断积累发展起来的。在无除草剂使用的种群中包含不同基因型的个体，其中带有敏感基因型的个体占主体，只有少量带有耐药基因的个体。在使用除草剂后，大量敏感个体的生长会受到抑制或死亡，而耐药的个体受到的影响则较小。长期的除草剂使用，种群中耐药的个体产生更多的子代，种群中耐药的个体积累，达到一定的阈值，种群就会表现出对除草剂的抗性（图1）。因此，对杂草抗药性进行治理，首先是在分子水平上找到抗药性形成的机制[4]。

图1 杂草抗药性在种群中的发展过程

1 杂草抗药性的分子机制

除草剂防治杂草的作用机制是除草剂分子喷施到杂草上，进入到杂草细胞中与细胞中的受体结合，导致受体的正常功能紊乱，从而导致的杂草生长发育受到抑制或死亡。在发挥作用的过程中会存在很多的阻碍的方式，这些都会导致除草剂不能发挥作用，从而使杂草表现出耐药的表型。根据这个过程，目前报道的主要机制包括靶标抗性、非靶标抗性等。

1.1 靶标抗性

选择性除草剂的开发主要就是依据其可以作用于特定的杂草的靶标，而不伤害作物。因此，除草剂靶标是抗药性研究中的重中之重。因为除草剂分子与杂草中靶标的接触是特异性的，因此杂草靶标上发生一些结构性的变化都有可能导致除草剂分子与杂草靶标的亲和力受到影响，造成除草剂起不到作用。靶标蛋白上发生的突变包括氨基酸替换、缺失、插入和可变剪接等。其中最常见的为部分位点发生点突变[4]。根据除草剂靶标蛋白的不同，目前主要的除草剂可分类以下几类：乙酰辅酶A 羧化酶抑制剂类、乙酰乳酸合成酶抑制剂类、光系统Ⅱ抑制剂类、乙酰羟酸合成酶抑制剂类和草甘膦等，分别作用于乙酰辅酶A 羧化酶（acetylˉCoA carboxylase, ACCase）、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, ALS）、光系统ⅡD1 蛋白（photosystem II D1 protein, PSII D1）、乙酰羟酸合成酶（acetohydroxyacid synthase, AHAS）和5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS）。目前在这些靶标蛋白上均发生过与抗药性有关的多种点突变（表1）。Palmieri 等[5]2021 年研究了ALS 蛋白上发生的A122S、A205V、D376E、W574L 和S653N 突变与长芒苋对ALS 抑制剂类除草剂的抗性有关。除此之外，一些靶标基因的扩增，也可导致抗药性的产生。据报道，EPSPS 基因在至少8 种杂草中扩增最多达到150 多个拷贝[6]。

表1 不同类型除草剂作用靶标和抗药性相关靶标突变位点

1.2 非靶标抗性

除了靶标抗性之外，一些杂草对除草剂的抗性还与其他的因素导致，其中主要的机制为代谢抗性[4]。一些代谢酶基因包括细胞色素P450 和谷胱甘肽S-转移酶等代谢能力的增强，会增强对除草剂分子的代谢能力，从而将有毒的大分子转化为无毒的代谢产物小分子，减小对植物的伤害。P450 通过NADPH P450 还原酶将氧分子插入除草剂分子降低其活性[7]；GST 通过将谷胱甘肽与除草剂分子结合，使其对杂草无毒性[8]。Wang 等[9]2013 年报道早熟禾和看麦娘对精恶唑禾草灵的抗性就与P450 基因过表达和基因扩增有关。Cummins 等[10]2013 年报道北方看麦娘和硬直黑麦草对多种除草剂的抗性就与GST 基因过表达和基因扩增有关。另外，通过阻碍除草剂的转移和液泡隔离除草剂的方式也能增强杂草对除草剂的抗性。Ge 等[11]2011 年使用31P 核磁共振对抗性加拿大蓬进行研究，发现液泡的隔离作用与杂草的抗药性产生有关。由于非靶标抗性不具有专一性，因此通常产生非靶标抗性的杂草也会对其他杂草产生交互抗性。

2 杂草抗药性机制研究技术

技术进步对科学研究具有巨大的推动作用，从最开始的表型生物测定到现在的分子生物学检测，技术的进步让抗药性的研究更加快速、方便。目前主要的研究技术主要有基于PCR 的技术、基于Sanger 测序的技术和基于二代测序的技术等。

2.1 基于PCR 的研究技术

PCR 技术广泛应用于分子生物学的研究，可以用于突变的分型和基因表达量定量。突变的分型是研究靶标突变的主要手段。设计特异性的引物对植物靶标基因片段进行扩增，含有特定基因型的片段可以被扩增，而不含有该基因型的片段则不会被扩增。PCR 等位基因特异性扩增（PASA）就被广泛用于靶标抗性基因型的检测。2011 年，Mátyás 等[12]使用双向等位基因特异性扩增技术（bi-directional PCR amplification of specific alleles，Bi-PASA）对抗三嗪类除草剂的豚草进行检测，发现光系统IID1 蛋白上的S264G 与抗药性产生有关。基因表达量定量是研究抗药性的重要手段。基于PCR 的实时定量PCR 技术能够对转录后的mRNA 进行定量计算。比较不同种群的杂草抗药性候选基因的表达量，可以得到差异表达的基因，则与抗药性表型有关。结合基因功能的研究技术，可以确定差异表达的基因是否与抗药性有关。Gaines 等[13]2010 年使用的实时定量PCR 技术对抗药性相关候选基因的表达量进行检测，发现EPSPS 基因在抗性的长芒苋中高表达，进一步研究其表达量升高是导致抗药性产生的原因，并且其表达量升高是由于EPSPS 基因的扩增导致的。

2.2 基于DNA 微阵列的技术

DNA 微整列技术又称为基因芯片技术，在硅片、玻璃等表面排列固定一些列的DNA 片段作为探针与待测样品的中的DNA进行杂交，杂交完成会发有荧光信号的产生，检测荧光就可以定性检测杂交是否进行和定量检测杂交的数量。靶标抗性突变的检测可以设计含有特定基因型探针进行检测，若DNA 片段杂交则说明存在特定的基因型。目前，微阵列主要用于检测杀虫剂靶标抗性突变，Chung 等[14]2011 年使用低密度的特异性等位基因探针微阵列分别检测与烟粉虱的拟除虫菊酯抗性相关的钠离子门控通道上的M918V、L925I、T929V 和有机磷农药抗性有关的乙酰胆碱酯酶上的F392W 突变，结果证明该检测方法表现出了极好的便捷性和准确性。检测基因表达量的测定是在芯片表面排列代谢基因片段，根据荧光信号的强弱来判断抗药性相关基因是否特异性表达。Pilcher 等[15]2017 年使用微阵列技术在全基因组范围内对DNA 微整列的技术对小麦抗赛克嗪品种和敏感品种的基因表达量进行检测，发现169 个基因的表达量上调，127个基因表达量下调。相比于基于PCR 的检测技术，其可以初步实现了高通量检测，但是也存在一些缺点的，准确性不如PCR 技术，因此检测的结果需要进行PCR 验证。

2.3 基于测序建立的技术

随着人类基因组计划提出以来，基因测序的技术经历了飞速的发展。对基因上发生的突变的检测，使用测序的手段无疑是最直接的了。早期的Sanger 法测序便能对靶标的序列进行测序，比较不同个体的基因序列就能快速找出发生的突变。Loubet 等[16]对抗甲氧咪草烟和苯磺隆豚草的ALS 基因进行Sanger 测序，发现9 个突变与豚草对ALS 抑制剂类除草剂的抗性有关。不过这样的测序技术需要设计引物扩增后逐个测序，费时费力。二代测序的出现改变了这一情况，对种群内的抽样的全部个体进行混样二代测序就能一次性的测序获得种群内的靶标上发生的全部突变信息，计算突变的频率，估算抗药性的发展情况。2020 年，Délye 等[17]使用扩增子测序技术对抗ALS 抑制剂类除草剂欧洲千里光的ALS 基因进行测序，发现D376E、A205T 和W574L 等突变均与其抗药性有关。Chen 等[18]2014 年对早熟禾的种子进行转录组测序，检测了ALS 蛋白上发生的突变，并计算突变的频率，检测结果可以用于估算杂草种群中抗药性的发展情况。转录组测序技术是目前高通量检测基因表达量的主要手段，通过对敏感和抗性种群进行混样转录组测序，可以方便地计算代谢酶基因表达量的变化。Wang 等2021 年对抗甲基二磺隆菵草和敏感菵草进行转录组测序，研究导致其产生非靶标抗性的机制，发现11 个contigs 在敏感和抗性种群间的表达量变化显著，其中主要为P450 和GST。

3 杂草抗药性机制研究展望

除草剂是现今集约农业中极度依赖的工具。杂草抗药性也是农业生产中巨大的挑战。经过近几十年的研究，杂草抗药性的主要机制已经基本明确。但是对于每种杂草每种除草剂的具体机制都不相同，可能是不同的突变也可能是不同的基因，这些都需要根据具体情况研究治理的手段。目前，虽然进行了大量的研究，但是这些研究很分散。我们要善于在已有研究的基础上总结，并进行更加深入的研究。比如利用互联网的便利条件，整理总结已有的研究构建数据库，给相关工作者提供更加全面的信息资源。同时也要善于引进新的技术，特别的组学技术不断发展的现在，使用一些新的技术可能完成以前需要费时数年的任务。当然，我们研究杂草抗药性的机制最终是服务于杂草抗药性的治理。基于机制的研究，基因编辑技术可以用于编辑特定的基因型，使得杂草不再具有抗性，或者开发新型的除草剂，缓解抗药性的进化压力。最后，利用生物防治也是能够缓解抗药性发展的重要手段，如利用的动物除草等。