基于AngⅡ/TLR4/NF-κB通路探讨滋阴潜阳方改善自发性高血压大鼠肾损害的机制

刘 阳，董昌武，徐 慧，程 斌，王奇林，廖岳闯

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

中国有超过2亿人口患有高血压病[1]，长期处于高血压状态会对患者心、脑、肾等靶器官的结构与功能造成严重损害[2]。早期肾损害若未得到有效控制，最终有可能导致肾功能衰竭。因此，治疗高血压病，控制血压是当务之急，预防及改善肾损害是重中之重。近些年来，许多研究表明，炎症反应对高血压病的发生、发展进程有不可忽视的影响，并且与高血压早期肾损害具有密切的联系。因此，对于炎症反应在高血压病对靶器官的损害方面的机制研究成为热点[3]。本课题组前期研究[4-5]表明，滋阴潜阳方可有效降低高血压大鼠血压并降低其肾组织中白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等炎症因子水平，从而改善高血压大鼠肾损害。但其具体的作用机制有待进一步探讨，基于上述研究，本实验将肾脏血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)/Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信号通路作为高血压肾损害炎症反应的特异性指标，采用自发性高血压(收缩压>160 mmHg)大鼠模型[6]进行实验研究，以滋阴潜阳方进行干预，并以依那普利为对照，观察滋阴潜阳方对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)肾脏保护的内在机制。

1 材料

1.1 实验动物 12周龄雄性清洁级SHR 40只，体质量(230±20)g，购自维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011]，收缩压为160～190 mmHg。室温下饲养，相对湿度为55%～60%，换气次数为每小时10～15次，昼夜明暗交替时间为12/12 h，饲料和垫料经高压灭菌，饮水为纯净水，自由摄水纳食。

1.2 实验药物 滋阴潜阳方：制何首乌、钩藤(后下)各20 g，熟地黄、生地黄、川芎各15 g，石决明(先煎)、煅牡蛎(先煎)各30 g。以上中药饮片，均购于安徽中医药大学第一附属医院中药房。煎煮方法：将药物以10倍量的水浸泡2 h，待药物完全吸水，煮沸1 h，过滤，将药渣再用8倍量水煮沸1 h，过滤，合并2次滤液，滤液置低温恒温反应浴浓缩至含生药质量浓度为2 g/mL，药液装瓶，4 ℃存储；依那普利(江苏制药股份有限公司，国药准字H32026567)购自安徽中医药大学第一附属医院西药房，每片10 mg。

1.3 主要仪器和试剂 大鼠无创血压测量系统(MS60)：上海玉研科学仪器有限公司；酶标检测仪(EPoch)：美国伯滕仪器有限公司；低温型研磨仪(kz-Ⅲ-FP)、RNA提取液(G3013)：武汉塞维尔生物科技有限公司；荧光定量PCR仪(CFX)：Bio-rad；对开门双门冰箱(BCD-518WEC)：合肥美菱股份有限公司；-80 ℃冰箱：合肥Royalstar；电子天平(ME203E/02)：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；AngⅡ、Ang(1-7)大鼠酶联免疫试剂盒(E-EL-R1430c、E-EL-R1138c)：武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 动物分组及干预措施 采用随机数字表法将SHR分为模型组、依那普利组、滋阴潜阳方低剂量组、滋阴潜阳方高剂量组，每组10只。胃内给药，根据实验动物学中常用实验动物与人的体表面积比例换算方法[7]，模型组每日给予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃，依那普利组每日给予依那普利1.05 mg/kg灌胃；滋阴潜阳方低、高剂量组每日分别给予5.85、23.4 g/kg(分别相当于成人临床用药等效剂量、4倍剂量)滋阴潜阳方汤剂灌胃，连续胃内给药6周，每日2次。

2.2 实验指标测定

2.2.1 血压测量 将大鼠放置于无创血压采集系统配套的鼠笼中，设定温度为37 ℃，进行15～20 min预热，使大鼠平静且尾部血运充盈，采用套尾法，确定环形尾套无漏气后，启动加压泵，在大鼠安静且清醒状态下，连续测量尾动脉收缩压3次，最后取平均值作为结果。分别于给药前、给药2周、给药4周以及给药6周测量并记录大鼠尾动脉收缩压值。

2.2.2 肾组织病理形态学观察 药物干预6周，第42天血压测量完毕后，禁食不禁水12 h，大鼠予以20%乌拉坦(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，于大鼠腹主动脉取血，将4 mL血液标本离心(3 000 r/min)10 min，收集上层清液，置于-80 ℃冰箱冻存待测。取大鼠左肾，用0.9% NaCl清洗并去除结缔组织，用滤纸拭干水分，分为两部分，一部分肾组织放入脱酶EP管中，于-80 ℃冰箱冷冻保存，用于检测大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65 mRNA含量，另一部分肾组织采用4%多聚甲醛固定液固定，经过24 h后，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。

2.2.3 大鼠血清AngⅡ、Ang(1-7)含量测定 采用ELISA法检测SHR血清中AngⅡ和Ang(1-7)的含量。按照试剂盒说明书进行检测，严格遵守操作步骤，使用酶标仪测得各孔在450 nm波长下的光密度(optical density,OD)值，然后根据标准品的浓度以及OD值作出标准曲线，最后再利用该标准曲线计算各组SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)的含量。

2.2.4 RT-qPCR法检测大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平 模型组及各药物干预组分别取肾脏组织100 mg加入到匀浆管中，研磨至无团块，按照实验说明书进行总RNA提取，然后进行PCR反应。反应条件：预变性，95 ℃ 10 min；变性，95 ℃ 15 s；退火，60 ℃ 30 s，一共经过40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算出各组大鼠肾脏TLR4、NF-κB-p65 mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 各组SHR治疗前后尾部收缩压比较 药物干预前，模型组及各药物干预组大鼠的血压值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组收缩压随着周龄增长而升高；给药2周后，与模型组比较，依那普利组与滋阴潜阳方高剂量组大鼠血压有不同程度的降低，依那普利组血压降低更明显(P<0.05)；自给药4周后起，与模型组比较，依那普利组，滋阴潜阳方高、低剂量组血压均显著降低(P<0.05)；组间比较发现，依那普利组较其他治疗组降压作用更明显，滋阴潜阳方高剂量组降压作用优于滋阴潜阳方低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组SHR治疗前后尾部收缩压比较

3.2 各组SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)含量比较 与模型组比较，各治疗组大鼠血清AngⅡ含量都呈现出不同程度的降低，血清Ang(1-7)水平都有不同程度的升高(P<0.05)；其中依那普利组血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高较其他两组更为显著(P<0.05)，滋阴潜阳方高剂量组血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高较滋阴潜阳方低剂量组更为显著(P<0.05)。见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05；与依那普利组比较，#P<0.05；与滋阴潜阳方高剂量组比较，△P<0.05

3.3 各组大鼠肾组织形态学观察 模型组大鼠肾组织结构重度异常，部分肾小球周围可见大量炎症细胞浸润(黑色箭头所示)，肾小管刷状缘脱落(黄色箭头所示)。滋阴潜阳方低剂量组大鼠肾组织结构明显紊乱，肾小球周围炎症细胞数量较模型组减少(黑色箭头所示)，部分肾小管刷状缘脱落(黄色箭头所示)。滋阴潜阳方高剂量组与低剂量组相比，损伤程度有很大改善，肾小球周围炎症细胞数量明显减少(黑色箭头所示)；依那普利组与其他3组相比，肾组织结构更为完整，肾间质仅可见少量炎症细胞浸润。见图2。

注：A.模型组；B.滋阴潜阳方低剂量组；C.滋阴潜阳方高剂量组；D.依那普利组

3.4 各组SHR肾脏组织TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平比较 与模型组比较，各治疗组大鼠肾脏组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。其中依那普利组TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平较其他两组降低更为显著(P<0.05)，滋阴潜阳方高剂量组TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平较滋阴潜阳方低剂量组降低更为显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组SHR肾组织TLR4、NF-κB p65mRNA表达水平比较

4 讨论

高血压肾损害可归属于中医学“腰痛”“肾劳”等范畴，是高血压病严重并发症之一。据研究[8]报道，高血压病的发生过程中多器官伴随着低水平炎症反应，而血压过高又会加重炎症反应，炎症过程中释放的炎症因子可促进高血压病的发展并对其靶器官造成损害。课题组前期通过临床观察发现，滋阴潜阳方能够通过补肾阴、益精血、活血祛瘀通络改善高血压早期肾损害患者的肾功能[9]，方中钩藤具有良好的降压作用，石决明、牡蛎潜阳，熟地黄滋肾阴、生地黄清热凉血养阴，川芎活血祛瘀通络，诸药合用，共奏潜阳降压、活络通瘀护肾之功。课题组前期实验发现，滋阴潜阳方能够对“两肾一夹”高血压大鼠早期肾损害起到保护作用[10]。本实验采用稳定的SHR进行研究，尽可能避免因外界影响造成或加重大鼠炎症水平。

高血压肾损害与血液中AngⅡ表达增多具有密切关系[11-12]，AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应物[13]，其作为一种强大的缩血管物质，可令局部血管张力增高，加重高血压病进展，激发炎症反应[14]，在高血压肾损害的过程中亦起着不容小觑的作用[15-16]。TLR4是Toll样受体参与慢性炎症作用中被研究较多的受体之一，AngⅡ可直接与血管内皮细胞上的TLR4结合，当AngⅡ过度表达时，可激活TLR4所介导的信号通路，从而激活其下游NF-κB并使之磷酸化，激活多种炎症因子，诱导炎症反应的产生，TLR4通过上调其下游因子NF-κB的表达调控多种炎症因子的释放，在高血压肾损害的发展中发挥着重要作用[17]。有研究[18]发现，可通过降低AngⅡ和TLR4、NF-κB p65的表达，抑制AngⅡ诱导的TLR4/NF-κB炎症通路激活，从而减轻高血压肾损害。这与本实验中滋阴潜阳方能够有效降低SHR血压、血清AngⅡ水平以及大鼠肾脏TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平的结果基本一致。本实验结果显示，通过6周的干预，与模型组比较，各药物干预组大鼠肾脏中TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表达水平明显降低，其中滋阴潜阳方高剂量组比滋阴潜阳方低剂量组下降更为明显(P<0.05)，表明滋阴潜阳方能够以降低血清AngⅡ水平、抑制TLR4/NF-κB通路激活的方式减轻肾脏损害。另外，肾脏形态学观察结果显示，经过治疗，滋阴潜阳方高剂量组、依那普利组大鼠肾脏结构较为清晰，与模型组相比，炎症细胞较少，说明大鼠血压升高的同时，对肾脏的损害开始加重，而滋阴潜阳方能够有效减少和改善SHR肾脏炎症浸润。

Ang(1-7)是重要的血管抑炎因子，其主要由血管紧张素转换酶2(angiotensin-coverting enzyme 2，ACE2)水解AngⅡ产生，Ang(1-7)在体内分布较广，主要分布于血液及肾脏血管等处，能够抗炎、舒张血管、稳定内皮细胞等[19-21]，进而起到降压、保护心脏、延缓动脉粥样硬化的作用，以减轻高血压病对心、脑、肾等靶器官的损害等[22-24]。戴亚东等[25]发现，Ang(1-7)可以显著降低SHR血压水平，并能够抑制内质网应激以保护心肌细胞，延缓左心室肥厚，表明利用ACE2/Ang1-7拮抗AngⅡ是一种有效且重要的降压方式。本研究结果显示，未施加干预因素的模型组大鼠，其血压随着时间的增加而增长；药物干预组从第4周开始，血压得到有效的控制，并呈现不同程度的降低，再次证明滋阴潜阳方有较好的降压效果。与模型组相比，滋阴潜阳方高、低剂量组大鼠血清AngⅡ水平降低，血清Ang(1-7)水平升高，且滋阴潜阳方高剂量组降压效果优于滋阴潜阳方低剂量组(P<0.05)，即存在量效相关性。结果表明滋阴潜阳方可以通过降低SHR血清AngⅡ水平扩张血管而降压，以及提高血管抑炎因子Ang(1-7)水平减轻血管炎症、舒张血管而降压，进而缓解高血压肾损害进展。由于Ang(1-7)主要是由ACE2水解AngⅡ产生，推测滋阴潜阳方可能有促进ACE2水解AngⅡ为Ang(1-7)的作用，并同时具有直接影响AngⅡ水平的作用，其内在作用机制有待后续实验研究。

综上所述，滋阴潜阳方能够在减轻SHR肾脏组织损害的同时改善其肾脏组织形态，起到延缓高血压肾损害的作用，其机制可能与调控AngⅡ/TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症因子过度表达有关。本研究在动物周龄、药物治疗时长的选择等方面需要优化，远期疗效与相关因素的关系仍需进一步探讨。