胃癌外泌体lncRNA MM2P诱导STAT6磷酸化而促进M2型巨噬细胞极化

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内胃癌的发病率位居第五，死亡率位居第三

。据统计，亚洲是胃癌发病率最高的地区，我国胃癌的发病数占全球胃癌发病数的一半左右

。传统的胃癌治疗方法主要包括手术、化疗、放疗等，肿瘤复发、癌症转移、肿瘤耐药等一直威胁着胃癌的治疗

。肿瘤免疫研究表明

，肿瘤微环境中的巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用，其中巨噬细胞分为M1型和M2型，M2型巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞，可帮助肿瘤细胞免疫逃逸。肿瘤外泌体为肿瘤微环境中的重要组成部分，可调控肿瘤微环境中免疫细胞的功能

，研究

表明，口腔鳞癌外泌体可促进M2型巨噬细胞极化，结直肠癌外泌体miR-934亦能够诱导M2型巨噬细胞极化而促进肿瘤的生长和转移。在胃癌细胞外泌体中亦存在多种生物活性物质而调控肿瘤的免疫逃逸，lncRNA MM2P能够通过调控巨噬细胞极化而调控肿瘤的发展

，但胃癌细胞外泌体中lncRNA MM2P表达水平及外泌体lncRNA MM2P对巨噬细胞极化的影响尚无研究，本文即探究了胃癌细胞外泌体中lncRNA MM2P对巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901，人单核细胞系THP1(购自中科院上海细胞库，CAS号：CBP60512、CBP60485、CBP60500、CBP60518)，佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(购自美国Sigma公司，CAS号：16561-29-8)，PrimeScript

试剂盒(购自日本Takara公司，CAS号：e237)和PowerUp

SYBR

Green Master Mix试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific公司，CAS号：A25743)，脂质体Lipofectamine

2000试剂盒(购自美国Invitrogen公司，CAS号：11668)，lncRNA MM2P过表达质粒(lncRNA MM2P)及空白质粒(Vector)(购自上海汉恒生物技术有限公司，CAS号：HB4008、HB3891)，CD63、CD81、CD9、p-STAT1、p-STAT6、STAT1、STAT6、GAPDH抗体、山羊抗兔IgG(购自英国Abcam公司，CAS号：ab134045、ab79559、ab236630、ab109461、ab263947、ab109320、ab32108、ab8245、ab150077)。

最后，一定要改变教师的教学模式和学生的学习方式。课件教学、学案教学、“杜兰口”模式、“思洋”模式等都是合作学习的一些有益探索，但它们只是教学的不同形式而已，形式无关紧要，关键是我们要积极地倡导问题化、参与式、探究性学习，调动学生学习的主动性和创造性，引导学生积极地去探究历史问题，能够运用辩证唯物主义和历史唯物主义的基本观点和方法、从不同的角度去观察、分析、说明和论证历史问题，能够独立地对历史问题和历史观点提出不同的看法，要有自己的见解并且言之有理、言而有据。

THP1细胞于体积分数为5%的CO

，37 ℃条件下培养在RPMI-1640培养基中，THP1细胞与100 ng/ml的PMA共孵育诱导其极化为M0型巨噬细胞，M0型巨噬细胞与50 ng/ml IFN-γ和1 μg/ml LPS共孵育诱导分化为M1型巨噬细胞；M0型巨噬细胞与20 ng/ml IL-4和20 ng/ml IL-13共孵育诱导其分化为M2型巨噬细胞。

实践性、应用性较强的市场营销专业培养的毕业生应具有的创新、创业精神、创新创业能力，与创新创业教育的核心在本质上是一致的，将专业教育与双创教育进行融合是高等教育发展的改革路径之一。双创教育必须以专业教育为载体贯穿于人才培养的全过程，专业教育是双创活动的核心要素，二者相辅相成、相互融合、相互促进。专创融合教育的实践取向是构建综合型人才培养的高校教育体系，并通过构建综合型人才培养的教育目标、重构课程内容、加强学生创新技能培养的教学实践等予以实现。师资队伍在高校创新创业教育与专业教育互动融合中扮演着至关重要的作用，应当积极实施创新驱动，强化高校创新创业教育与专业教育互动融合中的师资队伍建设。

以表 6中的标准化综合得分为响应值，采用Design-Exper8.0.6对数据进行多元回归拟合处理，获得标准化综合得分的二次多项回归方程为：

胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901培养于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基中，置于体积分数为5%的CO

，37 ℃细胞培养箱中，隔天更换培养基，培养至汇合率达80%时进行细胞传代。

透射电镜观察结果显示，本研究提取的GES-1 exo、MGC-803 exo、SGC-7901 exo具有双层膜结构，粒径为30～100 nm，形态呈“杯托”样，符合外泌体的结构特征。Western blotting鉴定结果显示，本研究提取的GES-1 exo、MGC-803 exo和SGC-7901 exo表达外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81(见图1)。

使用Trizol试剂盒提取各组细胞RNA，使用The exoRNeasy serum/Plasma Maxi Kit试剂盒提取外泌体中miRNA，利用核酸定量仪定量后，利用PrimeScript

试剂盒合成mRNA的cDNA，PowerUp

SYBRTM Green Master Mix试剂盒进行qRT-PCR，使用2

法计算相对表达量，引物序列如表1所示。

通过个相对比，我们最终选择了ASP．NET与SQL Server2008为开发平台，开发语言选择的是具有强大功能的C#语言。

取M0型巨噬细胞接种至6孔板中，根据Lipofectamine

2000脂质体转染试剂盒，将lncRNA MM2P过表达质粒及空白质粒(记为lncRNA MM2P组和Vector组)，转染至M0型巨噬细胞，继续培养24 h后进行后续研究。

使用RIPA蛋白裂解液试剂盒提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒蛋白定量后，每组取10 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的BSA溶液膜封闭2 h，以1∶1 000比例稀释的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应30 s，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

2 结果

细胞共培养：将M0型巨噬细胞与10 μg/ml的各组外泌体共孵育48 h后收集细胞进行后续研究。

比赛中，当运动员技术动作所需达到的目标明确时，判断准确、技战术运用得当、思维清晰、反应及时，较容易进入流畅状态。

qRT-PCR检测结果显示，相比于GES-1细胞，MGC-803和SGC-7901细胞中lncRNA MM2P均显著高表达(

<0.001)，相比于GES-1 exo，MGC-803 exo和SGC-7901 exo中lncRNA MM2P均显著高表达(

<0.001)(见图2)，说明lncRNA MM2P在胃癌细胞及其外泌体中高表达。

(5)沸腾炉高温烟气经沸腾炉沉灰室进入烘干转筒烟气管，此时烟气温度在750 ℃左右，烘干转筒进矿端(高温端)烟气管壁温度在200 ℃(因为与矿接触，矿中含有5%～8%左右的水分)左右，而排矿端的烟气管壁温度在80 ℃左右。钛精矿在整个烘干过程中温度较低，钛精矿表面的大部分药剂不会发生或很少发生脱离、气化、氧化、燃烧、碳化、焦化、裂解等化学反应(从前面浮选药剂的性质看出，大部分药剂的沸点、燃点都较高，通常在200～300 ℃，几乎不会产生新的化学物质，从而减少异味气体的来源；

为了探究lncRNA MM2P对M2型巨噬细胞极化的影响，M0型巨噬细胞细胞中转染lncRNA MM2P过表达质粒，构建差异表达lncRNA MM2P的M0型巨噬细胞后，加入IL-4和IL-13诱导巨噬细胞M2型极化，qRT-PCR检测结果显示，相比于Vector组，lncRNA MM2P组细胞M2型巨噬细胞标志物CD206、CD163、IL-10表达显著上调(

<0.001)(见图5)，说明lncRNA MM2P可显著促进M2型巨噬细胞极化。

王蒙徽在致辞中表示，我们要深入贯彻落实习近平生态文明思想，顺应人民群众对良好生态环境的新期待，大力推动绿色城市建设和城市发展。园博会要办成贯彻落实新发展理念的综合性博览会，并结合世界城市日活动，不断增强国际影响力，逐步打造成为展示城市建设和城市发展新理念、新技术、新产品的综合性国际平台。要充分展示贯彻落实新发展理念的生动实践，充分展示城市建设和城市发展的最新成果，充分展示中国传统和现代的营城理念和智慧，总结出一批可复制可推广的经验，推动城市建设和城市发展水平不断提升。

将MGC-803细胞中转染lncRNA MM2P及Vector，然后提取MGC-803细胞所分泌的外泌体(MGC-803/Vector exo和MGC-803/lncRNA MM2P exo)，qRT-PCR检测结果显示，相比于MGC-803/Vector exo，MGC-803/lncRNA MM2P exo中lncRNA MM2P表达显著上调(

<0.001)，由此获得差异表达lncRNA MM2P的外泌体，将MGC-803/Vector exo和MGC-803/lncRNA MM2P exo分别于M0型巨噬细胞孵育，然后加入IL-4和IL-13诱导M2型巨噬细胞极化，qRT-PCR检测结果显示，相比于MGC-803/Vector exo组，MGC-803/lncRNA MM2P exo组细胞CD206、CD163、IL-10表达显著上调(见图7)，说明外泌体lncRNA MM2P可显著促进M2型巨噬细胞极化。

qRT-PCR检测诱导巨噬细胞分化结果显示(见图3)，M1型巨噬细胞IL-6、CCR7、TNF-α表达显著上调(

<0.001)，M2型巨噬细胞CD206、CD163、IL-10表达显著上调(

<0.001)，说明巨噬细胞诱导分化成功。qRT-PCR检测诱导分化后巨噬细胞lncRNA MM2P表达结果显示(见图4)，相比于M0型巨噬细胞，M1型巨噬细胞中lncRNA MM2P表达无变化，M2型巨噬细胞lncRNA MM2P表达显著上调(

<0.001)，说明lncRNA MM2P高表达于M2型巨噬细胞。

为了探究胃癌细胞外泌体对巨噬细胞极化的影响，将10 μg/ml GES-1 exo、MGC-803 exo、SGC-7901 exo与M0型巨噬细胞共孵育48 h后，加入IL-4和IL-13诱导M2型巨噬细胞极化，qRT-PCR检测结果显示，相比于GES-1 exo组，MGC-803 exo组和SGC-7901 exo组细胞CD206、CD163、IL-10表达显著上调(

<0.001)(见图6)，说明胃癌细胞外泌体可以诱导M2型巨噬细胞极化。

将GES-1、MGC-803、SGC-7901细胞培养基更换为含质量浓度为100 g/L无外泌体胎牛血清的DMEM培养基，细胞培养48 h后，收集细胞培养上清液3 000×

，4 ℃离心15 min去除死细胞；收集上清液6 000×

,4 ℃离心40 min，去除细胞碎片,收集上清液；10 000×

,4 ℃离心1 h，取上清液；100 000×

,4 ℃离心1 h，收集沉淀，用400 μl无菌 PBS重悬外泌体，-80 ℃条件下保存。透射电镜下观察外泌体的形态结构，拍照记录；Western blotting鉴定外泌体标志蛋白CD63、CD81、CD9。

Western blotting检测结果显示，相比于MGC-803/Vector exo组，MGC-803/lncRNA MM2P exo组细胞STAT1磷酸化水平无变化(

>0.05)，STAT6磷酸化水平显著增加(

<0.001)(见图8)，说明胃癌细胞外泌体lncRNA MM2P能显著促进STAT6磷酸化水平。

3 讨论

肿瘤微环境组成复杂，由基质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、细胞分泌物等多种物质组成

，共同为肿瘤的生长和转移提供有利的环境，肿瘤微环境中的浸润性免疫细胞主要包括中性粒细胞、T细胞、巨噬细胞等，其中肿瘤相关巨噬细胞在浸润性免疫细胞中的占主要部分，主要包括存在于肿瘤早期发挥抗肿瘤作用的M1型和主要存在于肿瘤晚期发挥促肿瘤作用的M2型

。肿瘤微环境中的多种活性物质共同促进肿瘤相关巨噬细胞的极化水平，研究

表明，肿瘤微环境中的外泌体可调控M2型巨噬细胞的极化，例如，结直肠癌外泌体miRNA通过调控CXCL12/CXCR4而诱导巨噬细胞极化而促进肿瘤的转移，口腔鳞状细胞外泌体CMTM6通过调控ERK1/2信号通路而诱导M2型巨噬细胞极化。本研究探究了胃癌细胞外泌体对巨噬细胞极化的影响及机制，旨在为胃癌的临床研究提供帮助。

lncRNA是一类长度>200个核苷酸的非编码RNA，lncRNA在肿瘤中的表达与肿瘤的生长、转移、免疫逃逸、耐药等密切相关，并有研究

指出lncRNA有望成为用于肿瘤诊断和治疗的新靶点。越来越多的研究

表明，肿瘤细胞外泌体中能够向肿瘤微环境传递lncRNA而调控肿瘤微环境的形成。本研究检测发现,lncRNA MM2P在胃癌细胞及其外泌体中高表达，提示肿瘤微环境中的外泌体lncRNA MM2P可能具有调控肿瘤微环境形成的作用。

肿瘤相关巨噬细胞为肿瘤微环境中的主要免疫细胞，M1型巨噬细胞可被IFN-γ和LPS激活，分泌细胞因子而发挥促炎和抗肿瘤作用，IL-4 和IL-13可诱导M2型巨噬细胞极化，进而促进肿瘤的免疫逃逸

，本文诱导M1和M2型巨噬细胞极化后，检测发现lncRNA MM2P在M2型巨噬细胞中表达显著上调，提示lncRNA MM2P与巨噬细胞M2型极化相关。将lncRNA MM2P转染至M0型巨噬细胞后，检测发现M2型巨噬细胞标志蛋白CD206、CD163、IL-10显著上调，M1型巨噬细胞标志蛋白IL-6、CCR7、TNF-α无变化，说明lncRNA MM2P能够促进M2型巨噬细胞极化。

肿瘤外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响密切，研究

表明，结直肠癌外泌体中lncRNA RPPH1可调控TUBB3表达而诱导M2型巨噬细胞极化，肝癌外泌体中lncRNA TUC339可调控巨噬细胞的激活和极化。本研究发现，MGC-803 exo和SGC-7901 exo可促进巨噬细胞CD206、CD163、IL-10表达，说明胃癌细胞外泌体可显著促进M2型巨噬细胞极化，并且MGC-803/lncRNA MM2P exo也可显著促进M2型巨噬细胞极化，说明胃癌外泌体lncRNA MM2P可促进M2型巨噬细胞极化。

巨噬细胞的极化受多种信号通路的影响，干扰素可活化STAT1促进巨噬细胞M1型极化，STAT6途径是细胞因子IL-4和IL-13的常见信号传导途径

。IL-4和IL-13与其受体结合后激活STAT6磷酸化，p-STAT6转移至细胞核后可激活M2型巨噬细胞特异性靶基因的表达

，本研究发现，MGC-803/lncRNA MM2P exo可显著促进STAT6的磷酸化，而对STAT1的表达无影响，说明外泌体lncRNA MM2P可通过促进STAT6的磷酸化而促进M2型巨噬细胞的极化。

综上所述，胃癌外泌体lncRNA MM2P诱导STAT6磷酸化而促进M2型巨噬细胞极化，但外泌体lncRNA MM2P的临床应用还需进一步探究。

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