VNTR分子标记在甜菜细胞质类型鉴定的应用研究

张 辉，王 良，付增娟，李晓东，赵尚敏，鄂圆圆，郑文哲，张自强，张必周，张惠忠

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031）

甜菜是二年生常异花授粉作物，是重要的蔗糖榨取原料。二年生作物的生育周期较长，制约了育种工作进程。线粒体是起源于α-变形菌门的内共生细胞器[1]；虽然线粒体拥有自己的基因组，但其遗传信息不足以维持线粒体的功能，需要大量的核基因进行相互作用[2]；不适当的线粒体-核相互作用可表现在寿命、雌性配子体发生或雄性配子体发生等过程[3-5]；线粒体-核相互作用对雄性配子体发生的影响已经在植物中得到了广泛研究，被称为细胞质雄性不育（CMS）[6]。目前，已在150 多种植物中发现了CMS[7]。CMS 的表达可以用一个遗传模型来解释，线粒体因子S 为“不育”，雄性不育与核因子Rf（恢复基因）相互作用，其显性等位基因抑制S 的作用。在这个遗传模型中，雄性不育只有在植物的非恢复等位基因时才能表达，基因型为［S］rfrf。在基因组中可能存在一个或多个Rf 基因[8]。例如，CMS-T 是玉米的3 种CMS 类型之一，需要Rf1（或另一个等效基因）和Rf2 恢复生育能力[9]。此外，当花粉育性分离复杂时，还提出一种本身不能恢复花粉育性但能修饰Rf 作用的修饰基因。DUVICK[10]在一些与玉米CMS-T相关的交叉试验中提出了修饰基因参与了生育能力恢复。因此，一些次要基因可能参与了CMS 的表达，这意味着CMS 处于一个复杂的遗传系统的控制之下。CMS 是农业中的一个重要特征，因为它为大规模杂交种子生产提供了理想的种子亲本[11]。甜菜生产上使用的商业品种也是利用CMS 配制杂交种。甜菜育种者大量使用了OWEN[12]发现的细胞质雄性不育型材料（Owen 型不育系）。由于CMS 植物不能自花传粉，它们的繁殖需要与CMS 株系具有相同的核基因型且没有任何显性Rf 基因的亲本维持繁殖，但由于该亲本的线粒体基因育性正常，这种亲本被称为保持系，基因型为[N]rfrf。如果某植物和该CMS 植物杂交后的所有F1是雄性不育的，则该植物是保持系。

在甜菜育种工作中，不育系的利用能大大提高杂交育种的效率。通常在花期进行育性调查进而对保持系和不育系材料进行有效选择。但在调查过程中难免存在漏查和误查，从而导致后代选择的材料出现不纯现象。NISHIZAWA 等[13]开发出线粒体基因组里的TR1、TR2、TR3 和TR4 特异引物，发现线粒体基因组有4 个数目可变串联重复序列（VNTR）位点，在7 个基因型的甜菜中被检测出存在2～13 个不同的重复数。CHENG 等[14-15]利用VNTR分子标记的方法对42 个中国甜菜育种系正常和雄性不育型细胞质进行了鉴定分析，对不同的细胞质类型进行了梳理分类，并利用该技术对叶用和观赏甜菜种质资源的多样性进行了鉴定，鉴定出11 个多位点单倍型，总结了不同类型的细胞质类型特点。分子标记辅助选择技术的应用可以大大提高育种效率和数据准确性，本研究将已开发的VNTR 特异引物应用于二年生甜菜保持系和不育系胞质类型鉴选，旨在为提高甜菜育种效率、加速育种进程提供理论指导和技术支持。

1 材料和方法

1.1 供试材料

内蒙古自治区农牧业科学院自育或引进的甜菜材料40 份（表1），其中保持系960767 和不育系N9849 已经过多年田间调查验证，并经过分子鉴定应用[16]，为已成型稳定的成对保持系和不育系材料。其他鉴定材料为经过田间性状调查待鉴定胞质类型的材料，其中，材料1～21 拟选为不育系材料、22～40 拟选为保持系材料。

表1 试验材料名称情况

1.2 试验方法

1.2.1 取样和DNA 的提取

取样：每份材料各取10 株，在苗期取甜菜植株中心的新鲜幼嫩叶片2～3 片，称重0.8～1.2 g。将取样后的新鲜嫩叶置于超低温冷冻干燥机冻干48 h，将干燥后的样品分装置于2 mL 的离心管中，然后装入钢珠，用高通量破碎机将叶片打碎成粉末，之后即可用于DNA 的提取。冻干后的叶片可以在干燥的环境下长期保存。

DNA 的提取：选用新型植物基因组DNA 提取试剂盒（天根），对已经进行破碎处理的叶片进行DNA 的提取，操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 DNA 的检测

将提取后的DNA 样品5 μL 与6 × Loading Buffer 缓冲液1 μL 预混后点样5 μL，使用1%的琼脂糖凝胶在1×TAE 的电泳缓冲液中进行电泳，电泳条件为120 V、30 min 左右。用凝胶成像系统紫外光检测电泳结果。

1.2.3 PCR 扩增

TR1引物：5′-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3′，5′-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3′；TR2 引物：5′-TTAATTGCGAGACCGGAGGC-3′，5′-GAGCTTGCTC GCAGCTTATG -3′；TR3 引物：5′-AGATCCAAACAG AGGGACTG-3′，5′-CGGATCACCCTATTCATTTG-3′；TR4 引物：5′-AATGAGACCCGATTCTCTTC-3′，5′-GTTAAAAGCCCTTCTATGCC-3′[17]。PCR反应体系：15.0 μL 体系，包括7.5 μL×2 Taq Master Mix，1.0 μL上游引物，1.0 μL 下游引物，3.0 μL DNA，2.5 μL ddH2O。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 PCR 扩增产物的检测

将PCR 扩增后的产物点样5 μL，使用1% 琼脂糖凝胶1×TAE 的电泳缓冲液进行电泳。在100 V电压下电泳30 min 左右，凝胶成像仪照相保存图片。PCR 扩增产物回收及测序：选用普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（天根），对不同引物PCR 扩增后的产物进行回收，回收产物由测序公司进行测序。

1.2.5 田间育性性状调查

在甜菜开花始期（开花达到15%）进行田间性状调查，调查内容为甜菜花药的发育状况，花粉粒的特征和散粉的能力。二年生甜菜育性类型分为5 类：全不育型、半不育一型、半不育二型、半可育型、可育型[18]，具体性状类型见表2。

表2 花粉育性调查标准（5 级法）[19]

2 结果与分析

2.1 保持系和不育系材料不同鉴定引物检测结果

选用内蒙古自治区农牧业科学院甜菜育种课题自育材料：保持系960767、不育系N9849。这对材料已经过多年田间调查验证并经过分子鉴定应用，为已成型稳定的成对保持系和不育系材料。对已开发的TR1、TR2、TR3 和TR4 特异引物进行检测，检测结果见图1，保持系960767 标注为O，不育系N9849 标注为CMS。TR1 特异引物检测效果较其他特异引物差异更明显，保持系材料PCR 扩增条带位于750 bp，不育系材料PCR 扩增条带位于500 bp。TR3 特异引物PCR 扩增条带保持系材料位于500 bp，不育系材料PCR 扩增产物略小于保持系材料，但差异不明显。TR2 和TR4 特异引物PCR 扩增产物显示保持系和不育系材料差异不明显。

图1 保持系和不育系材料不同TR特异引物PCR 产物扩增效果

由图2 可知，不同材料经TR1 引物PCR 特异扩增后差异明显，重复性良好，经与成型和稳定的保持系和不育系材料鉴定比对材料960764 和N9857 细胞质类型为N1 型和Owen 型。

图2 不同保持系和不育系材料TR1 特异引物PCR 产物扩增效果图

由图3 可知，细胞质类型为N2 型和Owen 型的保持系材料OT302 和不育系材料MS301 的PCR 产物扩增效果。

图3 Owen型细胞质和N2型细胞质TR1 特异引物PCR 产物扩增效果

2.2 细胞质育性分子标记鉴定结果

试验利用不同的TR 特异引物检测了40 个试验材料的400 个植株样品。其中TR1、TR2、TR3、TR4 特异引物在Owen 型细胞质检测后的串联重复数为4、3、2、4。在N1 型细胞质检测后的串联重复数为13、3、3、3。在N2 型细胞质检测后的串联重复数为6、3、3、3。TR1 特异引物PCR 扩增产物Owen 型细胞质材料条带位于500 bp，N1 型细胞质材料条带位于750 bp，N2 型细胞质材料条带位于500～750 bp。其中21 个拟入选不育类型的材料中检测出符合Owen 型的材料有N9849-17-1、N9865-103-C1、N9857-5-1-TH1-400、MS321-C27-1-80、MS331-N70、MS343-80、MS117-3-6-4-2、MS301-500、MS351-80、MS327-70-80、MS333-70-80、MS335-N70、2068B-2、MS151-1-16-301-400、MS317-1-8-301、MS313-506-600、MS320-7-605-1-84（表3）。在拟入选不育类型的材料中检测出MS329-N70、MS323-503-600分别为N1 型和N2 型细胞质。材料MS351-80-1 和MS341-80 检测的材料结果并不完全一致，说明材料不纯，需要进一步选择纯化。MS351-80-1 检测了10 株，Owen 型细胞质类型7 株，N1 型细胞质1 株，N2 型细胞质2 株。MS341-80 总共检测了10 株，Owen 型细胞质类型7 株，N2 型细胞质3 株。19 个拟入选可育型材料中检测出符合N1 型细胞质的材料有960767-201TH-1、960764-1-11-1-1-400、OT322-C7-70-80、OT332-N70、OT352-80、OT328-70-80、BS301-13-9、OT352-80-1、OT342-80、OT152-1-6-301-400。N2 型细胞质的材料有OT302-500。在拟入选保持系材料中检出Owen 型细胞质类型960766 -1077 -c1、OT344 -80、OT118 -4 -5 -4 -4、OT324-501-600（表4）。拟入选的保持系材料OT152-1-1-C301、OT330-N70、OT334-70-80 和OT336-N70 检测的样品结果不一致，OT152-1-1-C301 检测了10 株，Owen 型细胞质类型2 株，N1 型细胞质8 株，OT330-N70 检测的10 株中Owen 型细胞质类型3 株，N1 型细胞质7 株，OT334-70-80 检测的10 株中N2 型细胞质3 株，N1 型细胞质7 株，OT336-N70 检测的10 株中Owen 型细胞质类型6 株，N2 型细胞质4 株。这说明4 个材料不纯，可以进一步套袋选择进行纯化。

表3 拟入选不育系材料检测结果

表4 拟入选保持系材料检测结果

2.3 田间育性性状调查结果

根据表2 所列的花粉育性调查标准进行田间育性性状调查，40 份试验材料共调查400 个植株样品，其中可根据调查结果将试验材料分为以下几类（表5），可育型包括：960767-201TH-1、960764-1-11-1-1-400、OT322-C7-70-80、OT332-N70、OT302-500、OT352-80、OT328-70-80、OT334-70-80、OT352-80-1、OT342-80、OT152-1-6-301-400、OT152-1-1-C301，这些材料均存在大量花粉并进行开裂；半可育型包括：960766-1077-c1、OT344-80、OT118-4-5-4-4、OT336-N70、BS301-13-9、OT330-N70、OT324-501-600，这些材料含有无受精能力的花粉粒及少量正常的花粉粒；全不育型包括：N9849-17-1、N9865-103-C1、N9857-5-1-TH1-400、MS321 -C27 -1 -80、MS331 -N70、MS343 -80、MS117-3-6-4-2、MS301-500、MS351-80、MS327-70-80、MS333-70-80、MS335-N70、MS351-80-1、MS341-80、MS151-1-16-301-400、MS317-1-8-301、MS313-506-600、MS320-7-605-1-84，这些材料无花粉，或含少数小孢子退化的花粉粒，花粉不开裂；半不育一型包括2068B-2，具有退化的小孢子或较之略发达的花粉粒，但不开裂；半不育二型包括MS329-N70 和MS323-503-600，这两个材料均有花粉膜，可见花粉孔，含多个花粉粒，但无受精能力，花药几乎不开裂。田间调查结果对应分子鉴定结果960766 -1077 -c1、OT344 -80、OT118 -4 -5 -4 -4、OT324-501-600，均为半可育型，但鉴定其细胞质类型属于S 型细胞质，根据欧文理论这些材料的细胞核基因应该含有可育基因X，这些材料在具体应用时不建议选作保持系材料。而MS329-N70 和MS323-503-600 属于半不育类型，但鉴定其细胞质类型不属于S 型细胞质，在选育过程中建议不用于不育系的选择。

表5 不同试验材料田间育性性状调查结果汇总

3 讨论与结论

甜菜育性基因主要是由细胞质和细胞核基因相互作用控制的。可变数目串联重复序列是具有高度遗传多态性和高度重复性的DNA 片段，其重复单位数目的可变性，是其长度多态性形成的主要机制。TOURMENTE 等[20]研究发现，可变数目的串联重复序列（VNTRs）在真核生物基因组中丰富且普遍存在。VNTR 既存在于小卫星DNA 中，也存在于微卫星DNA 中。BUARD 等[21]研究发现了一般微卫星序列（重复单元的长度为5 bp 或更短）和微型卫星序列（重复单元的长度为5 ～100 bp）。由于命名习惯影响以及为了便于区分，通常小卫星DNA 中的可变数目串联重复序列称为VNTR，而把微卫星DNA 中的可变数目串联重复序列称为STR。VNTR 的重复单位长度一般在6～70 bp，重复次数为数次至数百次。CONKLIN 等[22]研究发现，植物线粒体基因组的一个基本标志是其重复序列重组的倾向。所有测序的重组重复序列没有基因序列，这表明重组是通过同源机制而不是位点特异性机制发生的。不同小卫星在基因组中有特定的位置，就重复单位而言，它是多拷贝的，而对于特定基因座的片段长度等位基因而言，它又是单拷贝的。在同一基因座，每一个等位基因之间的长度差异刚好是重复单位的整倍数。不同座位的小卫星VNTR 序列间的核心序列有极髙的同源性。

甜菜线粒体基因组的可变数目串联重复序列（VNTRs）位点的特异性为区分正常细胞质和雄性不育细胞质提供了可能[13，17，23]。本研究利用已开发VNTR 特异引物（TR1、TR2、TR3、TR4）对内蒙古自治区农牧业科学院选育过程中的40 份材料进行细胞质类型鉴定。结合这些材料的田间性状调查，结果表明，4 个特异性引物中TR1 特异引物鉴定效果较好，TR1 特异引物PCR 扩增产物Owen 型细胞质材料条带位于500 bp，N1 型细胞质材料条带位于750 bp，N2 型细胞质材料条带位于500～750 bp。这主要是因为N1 型细胞质经TR1 特异引物PCR 扩增后的串联重复数为13，N2 型细胞质经TR1 特异引物PCR 扩增后的串联重复数为6，Owen 型细胞质经TR1 特异引物PCR 扩增后的串联重复数为4，因此扩增出来的N1 型和Owen 型条带差异较大，N 型和Owen 型条带差异较小。经分子鉴定结果不一致的材料6 份（MS351-80-1、MS341-80、OT152-1-1-C301、OT330-N70、OT334-70-80、OT336-N70），有待进一步纯化选择。其他材料分子鉴定结果与田间调查结果基本一致，虽有个别植株存在差异性条带与材料不纯和甜菜本身单株特异性较大有关。VNTR 特异引物的辅助选择为甜菜保持系和不育系下一步的选育工作提供了方向和参考，为成对保持系和不育系的选择提供分子水平的支撑。虽然该方法不能涵盖所有的甜菜类型，但可结合田间选育做出较为准确的判断，细胞核特异性引物的成功应用将更有效地推进分子辅助选择在甜菜育种中的应用。