虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓生长过程的毒性影响评价

宋 洁， 韩家旋， 叶 智， 雷 研， 段琪月

(1.陕西科技大学 化学与化工学院 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室， 陕西 西安 710021；2.西安长庆化工集团有限公司， 陕西 西安 710018)

0 引言

植物源提取物指采用适当的溶剂或方法，以植物为原料提取或加工而成的物质，可用于医药、食品、纺织、造纸等行业，作为添加剂和染料使用[1-3].与合成添加剂及染料不同，天然植物提取物大多源于自然界，故其来源广泛、可再生、生物相容性好、易于降解，并且无毒无害[4-6].某些植物源：如我国的中草药，还具有抗菌、消炎、防虫、抗过敏等特殊功效[7-11].虎杖(Polygonumcuspidatum)即为其中的一种，其所含有的蒽醌类成分为水溶性提取物的代表，同时具有广谱抗菌性[12-15].

可生物降解材料可以解决高分子合成材料带来的环境污染问题，使用后能够在堆肥、土壤、水或活化污泥等环境下被微生物或动植物体内的酶最终分解为二氧化碳和水，对环境友好.因此将植物源提取物与可生物降解材料共混，能够在对高分子材料着色的同时赋予其染色和抗菌功能性效果[16-19].但目前在材料复合及降解过程中，提取物中的成分是否发生变化，是否会产生有毒有害物质而对环境产生影响，对于该类复合材料对环境的影响评价尚未有定论.

利用动物的生长状况诊断土壤污染程度是间接判断环境污染情况的重要方法之一，蚯蚓即为其中的一种[20-22].本研究就是将天然虎杖提取物与可生物降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)复合，制备虎杖提取物/PBS复合材料.评价复合材料在降解过程中，对蚯蚓生长过程中蚯蚓体内蛋白质含量、过氧化氢酶(CAT)和纤维素酶活性的影响，为虎杖提取物/PBS复合材料的生态环境安全评价提供理论及数据支持，完善虎杖提取物/PBS复合材料的环境评价体系，为其产业化的实现奠定基础.

1 实验部分

1.1 主要原料

PBS：日本理学株式会社，Mn=1×104；天然虎杖(根部)：市售；无水乙醇：分析纯，天津市红岩化学试剂厂.抗热上海青605：市售；赤子爱胜蚓：市售；考马斯亮蓝G-250：温州市东升化工试剂厂；磷酸：天津市富宇精细化工有限公司；牛血清蛋白(BSA)：国药集团化学有限公司；磷酸二氢钠：天津市耀华化学试剂有限责任公司；磷酸氢二钠:天津市河东区红岩试剂厂；碳酸钙：天津市百世化工有限公司；丙酮：天津市致远化学试剂有限公司；三氯乙酸：上海山浦化工有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)：上海试剂二厂；愈创木酚：天津市科密欧化学试剂开发中心；过氧化氢：上海卒瑞生物科技有限公司；Tris碱：科昊生物工程有限责任公司；盐酸：北京化工厂；羧甲基纤维素钠盐：天津市福晨化学试剂厂；DNS指示剂：自制；葡萄糖：生兴生物技术有限公司；NaOH：天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.2 主要设备及仪器

SK-160开放式炼塑机：上海齐才液压机械有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE52CS-1旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1D-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-2006A紫外可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂；SPX-GB-250光照培养箱：上海博态实验设备有限公司；高速粉碎机：河南豫龙重工业机器有限公司；傅里叶变换红外光谱(FTIR)仪：VERTE-22型，德国 Bruker 公司；广角 X 射线衍射 (WAXD) 仪：AD/Max-3c 型；接触角测定仪：FM40MR2 Easydrop 型，德国KRUSS 公司.

1.3 虎杖提取物/PBS复合材料的制备

1.3.1 虎杖提取物的提取

将虎杖根部洗净，干燥后粉碎.以95%乙醇为溶剂，料液质量比1∶15，采用超声波辅助提取法对虎杖粉末进行提取.超声温度40 ℃，超声时间30 min，提取完毕后，40 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到粉末状虎杖提取物.

1.3.2 复合材料的制备

采用开放式炼塑机，调整辊子升温至110 ℃后开启滚筒，将PBS颗粒放入两辊之间，完全熔融后将虎杖提取物按照质量比1%、5%、9%分别加入PBS当中，待均匀混合后，混炼，制得虎杖提取物/PBS复合材料，冷却后取下粉碎备用.

1.4 测试与表征

1.4.1 FTIR 表征

采用溴化钾压片法制备样品，测试范围 500～4 000 cm-1.

1.4.2 结晶性能测试

40 kV，40 mA，Cu靶，扫描速度为 6 °/min.

1.4.3 亲疏水性

以蒸馏水在复合材料表面的接触角(θ) 表示复合材料的亲疏水性能，三次测量取平均值.

1.4.4 复合材料的降解性能

模拟自然降解测试：取陕西科技大学花园土，将其与水以质量比1∶5混合搅拌24 h后，静置24 h，取上层清液作为降解液.将不同比例复合材料裁成25 mm×25 mm×0.6 mm的试样，真空干燥后准确称量，并放入盛有降解液的离心管，置于摇床中模拟自然降解过程，每6天取样一次.取得试样用蒸馏水反复冲洗，干燥至恒重后称量，计算降解后试样的质量损失率.每组3个平行，取平均值.其降解率的计算公式为：

(1)

式(1)中：m为试样的质量损失率(%)；m0为试样的原始质量(g)；m1为降解后试样的质量(g).

GPC测试：采用大连依利特分析仪器有限公司EC2006凝胶渗透色谱仪来测定数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和分散系数，CHCl3作为流动相，流速为1 mL·min-1，试样浓度是1～3 mg·mL-1，注入量为15μL，温度40 ℃，标准样为PS.

1.5 蚯蚓生长环境评价

1.5.1 蚯蚓生态毒理学研究

研究物质对土壤生态环境毒性的一种常用方法是用蚯蚓进行实验.这是因为蚯蚓是一些高等动物的食物来源，并在环境中扮演着桥梁的作用.所以它常被作为评价物质对生态环境毒性大小的首选指示动物，关于实验研究方法有很多种，而关于研究小分支物质及有机污染物的方法主要有自然土壤急性毒性实验和自然土壤慢性毒性实验.

1.5.2 自然土壤急性实验

自然土壤急性实验是指在14 d内，将污染物与蚯蚓直接接触，在实验室条件下培养，并取样观察齐生理变化.

(1)自然土壤染毒

取陕西科技大学校园土风干.用500 mL烧杯做容器每只烧杯(500 mL)200 g土样.分别将以土壤量的2.2%加入粉碎后不同比例的虎杖提取物/PBS复合材料，或与不同比例复合材料中提取物含量一致的虎杖提取物混合均匀标记.每只烧杯加40 mL纯净水.每个比例设置三个平行样.

(2)蚯蚓清肠

取2 L烧杯，在底部铺上两层滤纸，加少量蒸馏水浸没滤纸.将购买的蚯蚓用温度约30 ℃的温水清理放入烧杯，将烧杯封口并用解刨针扎孔.将烧杯放入相对湿度70%的光照培养箱中白光条件20 ℃清肠12 h，蚯蚓清肠后如图1所示.

图1 已清肠蚯蚓的状态

(3)培养

将清肠后的蚯蚓洗净擦干称重，置于土壤中，每个烧杯内放10条长、体质量基本相同的蚯蚓，并设置CK(不添加提取物和PBS)、PBS(只添加PBS，含量为土壤量的2.2%)的两组对照.将容器封口并扎孔，以保持湿度和空气的通透性.将装有蚯蚓的烧杯放入光照培养箱中，恒温20±2 ℃，相对湿度75%，光照时间比12 h∶12 h交替培养.分别于7 d、14 d取样测定蛋白质含量、过氧化氢酶(CAT)和纤维素酶活性.每隔两天加适量的水补充蒸发，在整个实验周期内未见蚯蚓死亡.

1.5.3 自然土壤慢性实验

自然土壤慢性实验是指研究蚯蚓在与供试物接触后从14 d起添加相关物质供蚯蚓生存，并每隔一段时间测试蚯蚓的相关生理指标.

(1)、(2)与1.5.2自然土壤急性实验中(1)、(2)相同.

(3)培养

从培养第二周开始，每周在土壤表面添加一次磨细的干牛粪，并喷洒适量水分使牛粪湿润.添加标准为每条蚯蚓0.5 g牛粪.分别于在21 d、28 d取样测定蛋白质含量、过氧化氢酶(CAT)和纤维素酶活性.每隔两天加适量的水补充蒸发，在整个实验周期内未见蚯蚓死亡.

1.5.4 蚯蚓生理指标研究

经过大量实验表明，蚯蚓体内的酶活常被用做环境污染程度的生物指示物，其相关的生理指标有很多，但研究最多有蛋白质、纤维素活性、抗氧化物酶，其对蚯蚓的影响如下：

(1)蛋白质

蚯蚓体内的蛋白质含量约为50%～65%，包括十几种氨基酸和溶解酶.而正是由于这些溶解酶在一定条件下会发生溶解，所以将引起土壤环境的改变，如pH和湿度的改变，其溶解酶也会发生相应的变化，从而影响蚯蚓的生长.

(2)纤维素酶

蚯蚓在进食时，会摄取一些纤维素物质，而纤维素物质进入体内后，需要更多的纤维素酶消化纤维素物质，因此纤维素酶活的变化也可以用来指示蚯蚓受污染物的影响.

(3)抗氧化物酶

抗氧化物酶包括过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶.当蚯蚓受到外来刺激时，其体内的H2O2和O2·-会增加，因此会导致机体发生病变，这种解毒酶能够将其分解形成H2O和O2，从而减轻毒性维持机体氧化和抗氧化平衡，避免机体受到损害.因此通过CAT活性变化，可以有效判断污染物对蚯蚓作用的大小，同时间接反应污染物对环境的有害程度.

1.5.5 蚯蚓各项生理指标的测定方法

(1)蚯蚓中蛋白质含量的测定

将蚯蚓与pH 7.6的Tris-HCl缓冲液制备成1∶10(w/v)的组织匀浆，在高速冷冻离心机9 000 r/min转速下4 ℃离心15 min，取组织匀浆上清液与生理盐水按1∶4(v/v)稀释成20%的提取液.量取蚯蚓提取物溶液1.0 mL，加入考马斯亮蓝工作液5 mL混匀室温放置5 min，于595 nm处比色.

考马斯亮蓝试液配置方法：称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，溶解在50 mL 95%乙醇里，加入85%磷酸100 mL，加水定容至200 mL，4 ℃保持稳定.

蛋白质标准曲线的绘制：称量100 mg牛血清蛋白(BSA)，将其溶解于水中，定容至100 mL，得到1 mg·mL-1的BSA标准样.按表1中的顺序依次给试管编号，依照下表配置每管溶液，并向每个试管中加入5 mL考马斯亮蓝试液，混匀后，常温静置5 min，595 nm下测其吸光度.以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，得牛血清蛋白的标准曲线为：y=0.006 3x-0.006 1，R2=0.994 4.

表1 蛋白质含量标准曲线

(2)蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的测定

取蛋白质检测实验中的提取液，按照表2的方法加入试剂，配制完成后，立即开启秒表，测定240 nm处的吸光度值，每隔一分钟读取一次，计算CAT活性.

(2)

式(2)中：ΔA240为吸光度差；t为加H2O2到最后一次读数的时间(min)；V1：提取液总体积(mL；V2测定用提取液体积(mL)；W：为蚯蚓重量(g).

表2 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

(3)蚯蚓中纤维素酶活性的测定

底物溶液：边加热边将0.625 g羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)溶于100 mL水中用盐酸调节pH至4.4.

葡萄糖标准曲线的绘制：称取无水葡萄糖250.00 mg，溶于蒸馏水中，定容至250 mL，配制成0.1%葡萄糖标准溶液.分别吸取2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL 0.1%葡萄糖标准溶液，定容至50 mL，再分别吸取上述溶液2.5 mL于试管中，各加2.5 mL DNS指示液，煮沸5 min(另作1管对照，取2.5 mL蒸馏水，加入2.5 mL DNS指示剂，同样煮沸5 min).冷却后，用分光光度计在520 nm波长下比色，以葡萄糖的含量为横坐标，以A520nm 为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如表3所示.所得曲线回归方程为：y=0.859 4x-0.004，R2=0.999 6.

表3 葡萄糖标准曲线

纤维素酶活测定方法：取蛋白质检测实验中的提取液，以3 000 r·min-1进行第二次离心，其上清液即为纤维素酶的待测液.采用羧甲基纤维素法，取1 mL待测液，再往试管中加入4 mL底物溶液，40 ℃水浴5 min后，加入1 mL 1mol· L-1的NaOH溶液和3 mLDNS指示剂使反应终止.再将试管于沸水中加热5 min，冷却后用蒸馏水定容到25 mL摇匀，520 nm处测定其吸光度，计算纤维素酶活性.对照组的配制为加入等量的NaOH溶液和DNS指示剂后再加入1 mL待测液.

(3)

式(3)中：Ew为1 mL所用酶液中含有酶的重量(g).

2 结果与讨论

2.1 复合材料的红外光谱分析

图2为纯PBS和添加5%虎杖提取物/PBS复合材料的红外光谱图.从图2中可以看出，虎杖提取物为5%的复合材料与纯PBS相比，均出现了2 962 cm-1处甲基、亚甲基的伸缩振动吸收峰，1 714 cm-1处C=O的伸缩振动吸收峰，1 157 cm-1、1 045 cm-1处酯基中C-O的伸缩振动吸收峰，说明虎杖提取物的添加只是与PBS进行了共混，并没有发生化学反应.由图2还可以看出，添加虎杖提取物的复合材料中3 300 cm-1处-OH的伸缩振动吸收峰均较纯PBS有所增强，再次印证了所添加虎杖提取物有效成分中均含有一定量的亲水性基团-OH，导致复合后材料的-OH数量增多.同时，虎杖/PBS复合材料中C-O的伸缩振动吸收峰(1 024 cm-1)较纯PBS(1 045 cm-1)向低波数产生了移动，说明虎杖提取物成分中的-OH可能作为给电子基与PBS发生了分子间作用.

图2 虎杖提取物5%/PBS复合材料的FT-IR谱图

2.2 虎杖提取物对复合材料结晶性的影响

图3为虎杖提取物/PBS复合材料的X射线衍射分析.从图3中可以看出，纯PBS在020、021、110晶面显示出三组较强的特征衍射峰、在111晶面显示出一个较弱的特征衍射峰，而虎杖提取物/PBS复合材料与纯PBS相比其衍射峰的出峰位置基本相似，说明虎杖提取物的添加对PBS的结晶形貌几乎没有影响.但与纯PBS比较，随着虎杖提取物比例不同，复合材料在相同晶面的衍射角2θ均向小角度方向产生了移动，说明虎杖提取物在该比例下可以促进复合材料的结晶，使得球晶晶粒尺寸减小、结晶度升高.

图3 虎杖提取物/PBS复合材料的WAXD图

2.3 虎杖提取物对复合材料亲疏水性的影响

图4为虎杖提取物1%、5%、9%/PBS复合材料的接触角照片.从图4中结晶性能研究可以看出，虎杖提取物对PBS起到了促进成核的作用，从而会使得复合材料的球晶排列增加紧密，不利于水分子深入，亲水性应该是下降的.但从图4可以看出，当在PBS中加入虎杖提取物时，随着其含量的不断增大，复合材料的接触角较PBS呈现更加亲水性的状态，且接触角依次减小，再次验证虎杖提取物有较强的的亲水性，且其所产生的亲水效应大于结晶作用产生的疏水效应.

(a) PBS ( b)虎杖提取物1%/PBS复合材料 (c)虎杖提取物5%/PBS复合材料 (d)虎杖提取物9%/PBS复合材料图4 虎杖提取物/PBS复合材料的接触角

2.4 复合材料的降解性能

图5为虎杖提取物/PBS复合材料降解60 d的质量损失率.由图5可以看出，降解前期复合材料的降解速率明显要高于PBS，且随着提取物含量的增加，复合材料的降解速率在0～12 d内加速显著，12～30 d趋于缓慢，30 d后有所上升，提取物含量为9%的复合材料其降解速率最显著.说明当在PBS中加入提取物时，提取物作为小分子物质，能够首先作为碳源被微生物侵蚀，并在复合材料的内部形成不均一的孔洞.当提取物含量不断增加时，由于其本身的亲水性，导致在酶解的同时，进一步加速了水分子的侵入，使其与微生物及水分子的接触面积进一步增大.而析出的提取物小分子由于其具有较强的抗菌功效，使得其对降解环境产生的影响，因而在适应期中降解速率平缓.当微生物种群适应了降解环境后，复合材料的水解、酶解和提取物的降解仍协同产生，使得复合材料的降解速率持续增加.

表4为虎杖提取物/PBS复合材料降解前后的分子量及分散系数.从表4可以看出，PBS及不同比例复合材料降解后数均分子量及重均分子量都有所降低，但复合材料的降低程度随着提取物添加量的增加更加显著.同时降解后，复合材料的分散系数随着提取物添加量的增加较降解前呈现依次下降的趋势，再次印证了复合材料在降解时先从小分子物质开始降解，随着降解时间的延长，降解得以促进，PBS的酶解产物和提取物的降解共同对土壤环境产生影响.

图5 虎杖提取物/PBS复合材料降解60 d的质量损失率

表4 虎杖提取物/PBS复合材料降解前后的分子量及分散系数

2.5 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响

蚯蚓体内的蛋白质含量约为50%～65%，包括十几种氨基酸和溶解酶.而正是由于这些溶解酶在一定条件下会发生溶解，所以将引起土壤环境的改变，从而影响蚯蚓的生长.图6为虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响.表5虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响的数据及其误差统计.

从图6(a)可以看出：第7 d、第14 d时，虎杖提取物实验组与CK对照组及PBS对照组相比，蚯蚓中蛋白质的含量均大于CK对照组及PBS对照组，且随着虎杖提取物浓度的增大对蚯蚓体内蛋白质含量影响越明显.说明虎杖提取物对蚯蚓蛋白质的合成有明显的刺激作用，面对外来的刺激，蚯蚓会做出拮抗反应，即蚯蚓的体壁组织和肠组织分泌的酶会增加.提取物含量越高对蚯蚓产生的拮抗作用越强，因而蛋白质含量依次升高.在慢性毒性过程中，第21 d时，过量的PBS降解产物开始对蚯蚓中蛋白质的合成产生抑制，第28 d，虎杖提取物在添加量较大时，其中的抗菌成分使得土壤环境改性，开始影响蚯蚓蛋白质的合成，但影响小于PBS本身.

从图6(b)可以看出：虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响与只添加虎杖提取物的趋势基本相同，同样是急性毒性实验过程中，复合材料实验组蚯蚓中蛋白质的含量均大于CK对照组及PBS对照组，且随着虎杖提取物浓度的增大对蚯蚓体内蛋白质含量影响与明显.而第21 d、第28 d时，过量的PBS降解产物和降解的虎杖提取物同时开始对蚯蚓中蛋白质的合成产生抑制，但在小比例添加时复合材料对蚯蚓中蛋白质的影响均高于CK对照组及PBS对照组.两者对比，虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响趋势要优于虎杖提取物.

(a)虎杖提取物对蚯蚓中蛋白质含量的影响

(b)虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响图6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响

表5 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中蛋白质含量的影响

2.6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的影响

过氧化氢酶(CAT)是种抗氧化物酶，当蚯蚓受到外来刺激时，其体内的H2O2和O2·-会增加，因此会导致机体发生病变，这种解毒酶能够将其分解形成H2O和O2，从而减轻毒性维持机体氧化和抗氧化平衡，避免机体受到损害.因此通过CAT活性变化，可以有效判断污染物对蚯蚓作用的大小，同时间接反应污染物对环境的有害程度.图7为虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的影响.表6为虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶活性的数据及其误差统计.

从图7(a)可以看出：第7 d、第14 d时，虎杖提取物实验组与CK对照组及PBS对照组相比，蚯蚓中CAT的活性均大于CK对照组及PBS对照组，且随着虎杖提取物浓度的增大对蚯蚓体内CAT活性的影响越明显，但浓度过大时在第7 d蚯蚓还不能较好的适应外来抗菌效应对土壤的影响，因而在虎杖提取物添加量为9%时CAT活性较添加量为5%时略有下降.说明虎杖提取物的添加能够显著诱导CAT的活性，使得CAT的合成增加.第21 d时，PBS发生水解和酶解共同产生的小分子物质对蚯蚓中CAT的合成仍处于促进状态，而第28 d时，过多的小分子物质开始抑制CAT的活性.而虎杖提取物对蚯蚓中CAT活性的影响在整个慢性毒性过程中，均高于CK对照组及PBS对照组，且随着复合材料中虎杖提取物含量的增加，其影响呈现依次升高的趋势，再次说明虎杖提取物的添加能够显著增强CAT的活性.

从图7(b)可以看出：虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中CAT活性的影响与虎杖提取物的趋势基本相同，复合材料在降解协同作用下，在整个急性、慢性毒性过程中，对蚯蚓中CAT的影响仍高于CK对照组及PBS对照组，且随着复合材料中虎杖提取物含量的增加，其影响呈现依次升高的趋势，也说明虎杖提取物的添加增强了CAT的活性.同样第21 d时，PBS发生水解和酶解共同产生的小分子物质对蚯蚓中CAT的合成处于促进状态，而第28 d时，过多的小分子物质开始抑制CAT的活性.两者对比，虎杖提取物对蚯蚓中CAT活性的影响趋势要优于虎杖提取物/PBS复合材料.

(a)不同比例虎杖提取物对蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的影响

(b)虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的影响图7 不同比例虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)活性的影响

表6 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中过氧化氢酶活性的影响

2.7 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响

图8为虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响.表7为虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的数据及其误差统计纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，可将蚯蚓摄入体内的纤维素分解成寡糖或单糖.

从图8(a)可以看出：第7 d时，蚯蚓对PBS水解产生的小分子物质及虎杖提取物给予的刺激处于适应阶段，除虎杖提取物9%实验组外，其它实验组对蚯蚓纤维素酶活性的影响均小于CK组.第14 d时，虎杖提取物实验组蚯蚓中纤维素酶的活性均大于CK对照组及PBS对照组，且随着虎杖提取物浓度的增大对蚯蚓体内纤维素酶活性增大越明显，说明虎杖提取物的添加能够显著促进纤维素酶的合成.在慢性毒性过程中，第21 d、第28 d时，PBS对照组蚯蚓中纤维素酶的活性大于CK对照组，同时虎杖提取物实验组中纤维素酶的活性均大于CK对照组及PBS对照组，说明虎杖提取物对蚯蚓中纤维素酶的活性影响更显著.

从图8(b)可以看出：虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响在第7 d时，复合材料对照组对蚯蚓中纤维素酶的活性影响均小于CK对照组及PBS对照组，但随着提取物含量的增加，对纤维素酶的合成略有增加.第14 d时，复合材料实验组蚯蚓中纤维素酶的活性均大于CK对照组及PBS对照组，且随着虎杖提取物浓度的增大对蚯蚓体内纤维素酶活性增大越明显.在慢性毒性过程中，第21 d、第28 d时，同样PBS对照组蚯蚓中纤维素酶的活性大于CK对照组，且虎杖提取物实验组蚯蚓中纤维素酶的活性均大于CK对照组及PBS对照组，再次说明虎杖提取物能够促进蚯蚓中纤维素酶的合成.两者对比，虎杖提取物对蚯蚓中纤维素酶活性的影响趋势要优于虎杖提取物/PBS复合材料.

(a)虎杖提取物对蚯蚓中纤维素酶活性的影响

(b)虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响图8 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响

表7 虎杖提取物及虎杖提取物/PBS复合材料对蚯蚓中纤维素酶活性的影响

3 结论

(1)虎杖提取物的添加只是与PBS进行了共混，并没有发生化学反应.虎杖提取物的添加促进了复合材料的结晶，使得复合材料的亲水性增强且作为给电子基与PBS发生了分子间作用.在降解过程中，提取物作为小分子物质，首先被微生物侵蚀，使得复合材料与微生物及水分子的接触面积增大，且加速了水分子的侵入，使得复合材料的降解速率增加显著.

(2)虎杖提取物、虎杖提取物/PBS复合材料能够对蚯蚓中的蛋白质的合成起到促进作用，但复合材料的影响略大于提取物本身.同时两者均可增强蚯蚓中过氧化氢酶(CAT)、纤维素酶的活性，整个急性、慢性实验周期评价基本一致.

(3)所得研究中可通过研磨、提纯、旋转蒸发即可得到粉末状虎杖提取物，提取方法简易，成本较低.复合材料制备工艺简单，但可以达到既能对PBS染色，又可赋予PBS材料良好降解性的双功能性，提高了产品附加值并对环境友好，在可降解塑料领域有良好的应用前景.