磷酸化GluN2B亚基在α-syn A53T 转基因小鼠黑质中的表达变化

张佳惠,刘恒,王玉田,姜宏

(1 青岛大学国家生理学重点(培育)学科，山东 青岛 266071； 2 Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health and Department of Medicine, University of British Columbia, Vancouver, BC, V6T 2B5, Canada)

在帕金森病(PD)中，α-突触核蛋白(α-syn)在Ser-129 位点的磷酸化促进了α-syn的积累及路易小体的形成，对PD的发生发展起到重要作用[1-4]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体为离子型谷氨酸受体，具有高钙离子通透性，在学习与记忆中发挥重要作用[5-6]。该受体过度激活会导致细胞功能障碍和死亡，被认为是与许多神经系统疾病相关的神经元损伤的介质[7-8]。NMDA受体GluN2B亚基的C末端可以被酪氨酸激酶Fyn激活而发生磷酸化聚集在突触后膜上，而细胞内Fyn的表达可能受到α-syn的调控[9-10]。然而，NMDA 受体参与PD的发病机制仍然不明确。本实验旨在通过检测α-synA53T 转基因小鼠和野生型(WT)小鼠黑质区(SN)磷酸化GluN2B(p-GluN2B)蛋白表达水平，探究随PD进展GluN2B亚基活性变化，以期为PD提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物α-synA53T转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所，进行基因型鉴别，获得α-synA53T+/+小鼠和α-synA53T+/-小鼠。本实验选择12～15月龄的α-synA53T+/+小鼠和同窝WT小鼠各5只作为研究对象。小鼠饲养于SPF级环境中，设定室温为(22±2)℃、白昼与黑夜的光照时间为1∶1。

1.1.2仪器及试剂 p-GluN2B抗体(ABcam)；磷酸化α-syn(pS129 α-syn)抗体、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔二抗(Absin)；BCA试剂盒、SDS-PAGE loading buffer、RIPA裂解液、分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液(康为世纪)；ECL显色发光液、PVDF膜(Millipore)；电泳仪、电转仪(BioRad)；凝胶成像系统(General Electric Company)。

1.2 实验方法

1.2.1旷场实验 应用50 cm×50 cm的方盒旷场，方盒周壁及底部的颜色均不透明，将方盒底部平均分为4×4的16个小方格。摄像头置于方盒上方，可观察整个旷场，将小鼠轻轻放置在方盒中，黑暗中进行10 min的视频录制。每只小鼠测试结束后，清理方盒并应用乙醇消除气味后晾干，以防对下一只小鼠测试产生影响。采用SMART软件分析小鼠总运动距离及平均运动速度等数据。

1.2.2蛋白免疫印迹法检测SN区蛋白表达 小鼠麻醉后断头取脑，在冰上按照脑图谱完整取出中脑SN区。向脑组织中加入100 μL RIPA蛋白裂解液静置，置于研磨机中研磨。在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，离心结束后取上清液80 μL，在酶标仪上用BCA 法测定蛋白浓度。加入5×蛋白loading buffer混匀，100 ℃金属浴煮沸，根据BCA法检测数据确定上样量。按照所需蛋白分子量配胶，电泳完成以后转膜(300 mA、100 min)。按照Marker切下需要的目标条带，用100 g/L脱脂奶粉封闭，室温孵育2 h；分别加入用一抗稀释液配制的p-GluN2B抗体(1∶1 000)、pS129 α-syn 抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶10 000)，置低速摇床上4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗脱3次，半小时后加入山羊抗兔的二抗(1∶10 000，TBST缓冲液配制)，置摇床上室温孵育1 h；以TBST缓冲液洗脱3次，擦干TBST后，加入适量ECL化学发光液进行显影。采用Image J软件分析条带灰度值，结果以p-GluN2B、pS129 α-syn与内参GAPDH 灰度值的比值表示。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 α-syn A53T+/+小鼠运动行为能力改变

α-synA53T+/+小鼠和WT小鼠在开放旷场的总运动距离分别为(2 575.0±293.7)、(3 655.0±225.1)cm(n=5)，α-synA53T+/+小鼠旷场总运动距离较WT小鼠减少，差异具有统计学意义(t=2.920，P<0.05)。α-synA53T+/+小鼠和WT小鼠的平均运动速度分别为(4.302±0.480)、(5.898±0.415)cm/s(n=5)，α-synA53T+/+小鼠平均运动速度较WT小鼠减慢，差异具有统计学意义(t=2.518，P<0.05)。

2.2 α-syn A53T+/+小鼠中脑SN区p-GluN2B 和pS129 α-syn蛋白表达变化

α-synA53T+/+小鼠和WT 小鼠中脑SN区p-GluN2B蛋白的表达水平分别为1.115±0.141和0.706±0.087(n=5)，α-synA53T+/+小鼠SN区p-GluN2B蛋白的表达水平较WT小鼠明显升高，差异具有统计学意义(t=2.470，P<0.05)。α-synA53T+/+小鼠和WT 小鼠SN区pS129 α-syn 蛋白的表达水平分别为1.277±0.219和0.433±0.094(n=5)，差异具有统计学意义(t=3.533，P<0.05)。

3 讨 论

NMDA受体为谷氨酸门控离子通道，在中枢神经系统中广泛表达，并在兴奋性突触传递中起着关键作用[11]。NMDA受体共包含3种类型的亚基(GluN1～3)，亚基结构间具有高度同源性，均由氨基端、配体结合区、跨膜区及羧基末端4个结构域组成[12-13]。越来越多的研究表明，在PD细胞模型和PD病人脑组织中，纹状体和伏隔核中谷氨酸与NMDA受体结合显著增加，而这可能会加速神经元退化过程[14-15]。有文献报道，在亚急性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)小鼠模型中，可以通过抑制mGlu2/3受体配体影响突触后Fyn/NMDA受体的功能[16]。最新的研究结果表明，在鱼藤酮小鼠模型中，GluN2B在mGluR5介导的内质网应激和DNA损伤中发挥着重要作用[17]。

上述研究揭示，在PD的进展过程中，NMDA受体介导的谷氨酸兴奋性毒性发挥作用。本文研究结果显示，12～15月龄α-synA53T+/+小鼠运动能力受损，与之前有关研究报道相吻合[18]。本文结果还显示，α-synA53T+/+小鼠SN区pS129 α-syn和p-GluN2B蛋白表达水平明显升高，说明在SN区出现了α-syn聚集，从而可能过度激活Fyn使GluN2B亚基表达过磷酸化。有研究报道，Fyn在Tyr1472处磷酸化GluN2B会抑制与网格蛋白接头AP-2的结合，最终会抑制细胞表面含有GluN2B的NMDA受体的内化[19-20]。因此我们推测，当p-GluN2B增多时，由于Fyn活性增强使GluN2B内化减少，导致大量Ca2+内流，这可能成为神经元损伤的重要原因。本研究为阐明NMDA受体参与PD发生发展的机制提供了思路，其具体机制还有待进一步探讨。