从“瘀毒伤络”论卵巢癌与外泌体的关系

李世颖，于 洋，韩凤娟

(1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤死亡的第二大常见原因[1]。过去30年，几乎所有癌症的5年相对生存率均提高了20%[2]。这与早期筛查、及时手术和治疗方式的进步密不可分。但在美国和加拿大等发达国家，在诊断为卵巢癌后5年生存率仍保持在47%，仅发生微弱变化；与此相比，乳腺癌的5年生存率高达85%[3-4]。全世界每年有23万余例新病例和15.2万例死亡病例，使卵巢癌成为第七大常见癌症[5]。卵巢癌早期症状不明显，发现时多为中晚期，且表现为腹胀、腹痛等非特异性症状，这使诊断及治疗的难度增加。研究表明，吸烟[6]、肥胖[7]、高脂饮食[8]等因素均可增加罹患卵巢癌的风险；免疫、遗传或精神因素等机体内环境亦可导致卵巢癌的发生。随着分子生物学技术不断发展，外泌体在妇科肿瘤中的作用备受瞩目。目前，对外泌体研究的重大突破主要集中在肿瘤进展、耐药性及临床诊断方面。研究表明，外泌体参与细胞通讯的生物学特性，不仅能介导卵巢癌细胞和微环境间的信号传递，亦能协助卵巢癌的诊断、治疗并干预预后[9]。卵巢癌在中医归属于“癥瘕”“积聚”等病范畴。其病胶着，迁延不愈，“久病入络，痼病必瘀”，瘀毒阻滞胞络，久之变生“癥瘕”。基于络脉理论与外泌体的生物特性相契合，“瘀毒伤络”又是卵巢癌的根本病机，因此，本文旨在通过外泌体在卵巢癌中的作用为切入点，探讨“瘀毒伤络”理论与卵巢癌的关系，为其指导卵巢癌的防治提供新的研究思路。

1 “瘀毒伤络”理论

络脉理论在中医学术发展长河中历经三个阶段，《黄帝内经》作为络脉理论的开端，为张仲景的《伤寒杂病论》中理论的延续与创新奠定了基石，经叶天士的《临证指南医案》对其理论进一步充实并突破，最终为络脉病变辨证治疗的学术理论打下了坚实基础。随着现代实验技术的发展，吴以岭院士遵循中医自身学科发展规律，提出“三维立体网络系统”[10]，认为络脉是核心，是维持人体动态平衡和稳定内环境的调控系统。络脉从经脉支横别出，将流注于经脉通道的营养物质、气血津液等渗灌至脏腑，弥散至周身，发挥“行血气而营阴阳”的作用[11]。《灵枢·经脉》言：“经脉者，所以能决死生，处百病，调虚实，不可不通。”而“瘀毒伤络”理论正是“瘀毒”损伤经脉、络脉，导致疾病迁延难愈。从机体内环境角度看，络脉血气满溢迟滞，荣卫周身受阻、停滞，蓄血成瘀；从外环境看，六淫、内伤七情、食滞、痰浊等病理状态则使气血运行缓慢，留滞成瘀。而古籍中记载：“无邪不有毒，热从毒化，变从毒起，瘀从毒结也”[12]。表明毒邪致病暴烈、顽固、复杂多变，且毒邪胶结难解亦可致瘀。《医林改错》言：“蕴毒在内，烧炼其血，血受烧炼，其血必凝。”故“毒邪”停居络脉煎灼阴液；亦或阴液受损，不能濡润经络脉道，二者均可致瘀。瘀血在脉内缠绵，充斥并阻滞脉络，蓄积日久不仅耗伤人体正气，亦可酿生毒邪，最终瘀毒互结，蕴生癥积。由此可见，“瘀”“毒”间存在必然联系。由瘀到毒形成瘀毒，是一个由量变到质变的过程：瘀为毒形成的物质基础，毒是瘀的发展和转归[13]。作为致病因素，瘀毒羁留客于络脉，不仅损伤络脉功能，也使络脉形态结构破坏，然与络脉相连的经脉和脏腑组织气机升降出入失常，而影响脏腑功能，最终破坏人体内环境稳态，且具有缠绵难愈之性。可以说，“瘀毒伤络”是各种难治性病证的病机归宿，其演变过程是疾病发展的病理概括，病机亦符合内伤杂证、疑难重证的传变规律。

2 卵巢癌与外泌体

细胞外囊泡(EV)于1946年首次提出[14]，几乎所有细胞都会释放不同类型的EV，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体[15]。由于起源细胞不同，EV的大小、特性和分泌途径各不相同。而外泌体是直径约为100 nm的小型EV，它们被释放到细胞外微环境中，目的是将其成分(mRNA、miRNA、DNA和蛋白质)转移到靶细胞中[16]。这些特异性分子信号调控着机体生理病理的全过程，如参与促进细胞增殖、血管生成，并通过调节靶细胞表型，诱发肿瘤和免疫抑制表型，推进肿瘤的发展过程。近年来，已研究发现外泌体可以参与卵巢癌的发病并对卵巢癌进展具有举足轻重的调控作用，其机制可能是通过促进特定癌基因在细胞间转移而导致卵巢癌细胞生长[17]、转移及血管形成[18]等。如Rashed等[19]经实验证实，卵巢癌细胞利用外泌体将肿瘤抑制性miR-940转移到细胞外环境中，从而维持其侵袭性和致瘤性。Ying等[20]发现卵巢癌细胞通过外泌体将miR-222-3p分泌至巨噬细胞，并以其作用于STAT3通路的SOCS3为靶点调节巨噬细胞的表型，使其从M1型(抑癌性)转变为M2型(能够抑制免疫应答、促进肿瘤生长与转移)，从而促进卵巢癌的进展。Melo等[21]指出，更具侵略性的卵巢癌细胞株能分泌更多的外泌体，提示外泌体与卵巢癌的恶性程度呈正相关。

癌症和肿瘤微环境间相互影响是癌细胞存活的必要条件。肿瘤微环境是细胞及其伴随的细胞外基质(EMC)共同作用的产物，细胞主要由基质细胞组成，包括成纤维细胞、巨噬细胞、间充质干细胞等；EMC由炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、整合素和外泌体构成[22]。肿瘤细胞与基质细胞交互作用，通过促进血管生成、浸润和转移等方式致使肿瘤生长并侵入其他组织[23]，并且它们共同形成了肿瘤的独特微环境。而作为肿瘤微环境中重要成员之一的外泌体通过旁分泌机制影响着肿瘤的进展[24]。卵巢癌衍生的外泌体将维持组织稳态和功能所必需的成纤维细胞转化为癌症相关成纤维细胞(CAF)[25]。CAF与活化的成纤维细胞间存在共性，它们表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，但不会发生细胞凋亡，也不会失去其活化的表型[26]，它们还可表达成纤维细胞活化蛋白，促进肿瘤进展[27]。然而，卵巢癌微环境中癌细胞和成纤维细胞之间的关系是错综复杂的。CAF最初可以限制肿瘤进展，类似于癌细胞与微环境免疫成分之间的关系[28]。但是，CAF最终会被转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白细胞介素-6 (IL-6)等生长因子激活。IL-6已被证明是卵巢癌肿瘤微环境中的重要细胞因子，可介导巨噬细胞成熟为M2巨噬细胞，通过血管内皮生长因子(VEGF)和TGF-β1增强肿瘤血管稳定性，从而促进肿瘤进展[29]。卵巢癌细胞来源的外泌体通过Smad2或Akt磷酸化诱导脂肪组织来源的间充质干细胞分化为CAFs[30]，不仅证明了CAFs与卵巢癌细胞之间的密切相互作用，而且还证明了卵巢癌细胞来源的外泌体具有改变其微环境的能力。此外，CAF衍生的外泌体含有TGF-β1，它通过激活Smad促使卵巢癌细胞的迁移与侵袭并促进上皮间质转化(EMT)[31]。已有多种证据表明，在成瘤的前提下，EMT赋予癌细胞更高的进化和转移潜能[32]。总体而言，肿瘤细胞和CAFs协同作用是一种互惠的正反馈机制，其中癌细胞产生激活和维持CAFs的因子，通过诱导癌细胞增殖、血管生成和细胞外重塑来促进肿瘤进展[26]。由此可见，肿瘤微环境中的基质细胞促进肿瘤的生长与侵袭，外泌体由其产生并促进它与肿瘤细胞间的通信与物质交换，二者协同改变肿瘤微环境并打破其平衡，从而导致卵巢癌的恶化发展。

3 “瘀毒伤络”与卵巢癌

古籍中虽然没有卵巢癌的明确记载，但现代医学依据本病的临床表现，可将其归为中医学“癥瘕”“积聚”等范畴。张景岳云：“瘀血留滞作癥，唯妇人有之。”《医宗必读·卷七》云:“女子癥瘕，多因产后恶露未净……逐渐积而为癥瘕矣。”表明癥瘕作为妇女特有的一种病症，瘀血既是本病的致病因素与病理产物，也是病机关键，并贯穿于其发展的全过程。逐渐形成瘀血蓄积在胞脉，可使邪毒内生，最终因瘀毒互结导致脏腑气血功能失调而成癥瘕。

《妇人良方大全》中说道“女子以血为本”，胞宫的经、孕、产、乳均以血为本，又《诸病源候论》所言：“风冷入余子脏，责令脏冷，致使无儿。若博于血，则血涩壅，亦令月水不利，断绝不通。”这说明妇女的生理功能、病理变化无不离血。《素问·奇病论》：“人有重身，九月而膺……胞之络脉绝也。”可见胞络为胞宫上的络脉，将脏腑化生的气血经冲、任、督、带、十二经脉渗溉、循环至胞宫以维持女性的生理功能。而《素问·骨空论》曰：“任脉为病……女子带下瘕聚。”络脉受损，可使癥瘕内生，证实了卵巢癌的发病与络脉损伤的相关性。

《医学衷中参西录》曰“因气血虚者，其经络多瘀滞”，络脉中最易导致的病理状态及病理产物即血瘀[33]。瘀血、毒邪等诸邪在络脉、胞宫中循环不止且长期阻塞络脉、胞宫，作用于络脉、胞宫的微环境，间接推动卵巢癌的发生；当瘀毒随脉络走窜肆意横行络脉、胞宫，导致机体脏腑内环境与肿瘤微环境之间的气机升降异常而出现肿瘤转移；瘀毒积存日久，耗伤机体脏腑内环境，瘀毒使络脉、胞宫微环境中血管间隙大，损害血管，发生恶性循环而使卵巢癌缠绵复发。可见瘀毒打破胞宫、脉络微环境平衡，影响卵巢癌发生、转移及复发。

3.1瘀毒伤络发为卵巢癌 当外有邪侵袭，内有饮食失调、情志不畅等因素，二者协同作用于人体，影响脏腑气血运化功能，则经络循行不畅，碍滞气机升降出入，使血液流通不畅，停滞成瘀。从微观角度看，络脉是通道，负责运行气血、联系形体官窍、疏通周身上下；从宏观层面看，它也是机体最重要的运毒、排毒管道[34]。因此瘀毒易积存于络脉造成瘀堵，而且极易形成有形之积破坏络脉、胞宫微环境，产生原发病灶，日久邪毒滋生，瘀毒搏结留滞于胞络，则肿块生长迅速并向恶性发展。

3.2瘀毒伤络走窜,促使卵巢癌转移 瘀毒伤络在卵巢癌病变过程中发挥核心作用。最初瘀毒伤络，阻滞气机，影响脏腑气血运行，进而瘀毒相互纠葛、走窜，通过络脉输布各分支，使病变范围不断扩大，波及周身，形成新的病灶，引起多脏器损伤。隋代巢元方《诸病源候论卷十九·癥瘕候》言：“癥者……聚结在内，逐渐生长，块段盘牢不移者……人即柴瘦，腹转大……必死。”可见随着原发病灶的逐渐生长，人体正气被耗伤，瘀毒肆意走窜而使病情恶化。进而不断增大的病灶阻滞局部经络，气血津液不能运行于一身上下，导致机体脏腑内环境与肿瘤微环境之间的气机不相顺接，机体平衡失调，使原本耗伤的正气日渐虚损，由此循环往复，促进肿瘤的发展及转移。可以说，瘀毒伤络持续发展成为卵巢癌转移的重要因素。

3.3瘀毒伤络缠绵，导致卵巢癌复发 瘀毒伤络缠绵，日积月累耗损人体正气，《医宗必读》中说道：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”最终瘀、毒、邪相互致病拥塞络脉致使枢机不利，气血津液无以化生或窒碍难行，使脏腑功能虚衰。然血无以化生或失于鼓动，气机瘀滞，使瘀、毒、邪等病理产物结聚络脉缠绵纠结。由此循环进一步打破络脉、胞宫微环境致使卵巢癌复发。“病久入深，营卫之行涩，经络时疏，故不通”，瘀毒伤络的性质潜伏隐匿，病变多发，久不化解，即使经过及时治疗，残留的瘀、毒、邪也可通过经络继续攻击一身上下，持续耗伤正气，而且易形成新的病灶导致疾病复发。

4 “瘀毒伤络”与外泌体

机体的整体变化往往伴随着微观物质的改变，外泌体的研究属于微观分子学，但其宏观、整体表现出来的生物学特征与中医理论的整体观念不谋而合。从细胞分子角度分析，当疾病发生时，机体细胞相互作用并分泌外泌体，导致其结构发生形态学变化，生物学功能亦相应改变。因此，可以将外泌体与中医理论相结合，即微观生物学变化与中医整体观相契合。

在源自卵巢癌细胞的外泌体中已鉴定出大约2 000种蛋白质。外泌体通过携带和输送蛋白质形成细胞间信息传递系统，在肿瘤细胞和微环境中发挥双重作用，而且，通过高度富集的信号通路与致癌作用相关性分析发现，这些蛋白质中的很多因子与恶性肿瘤的发生与进程密切相关[35-36]。在卵巢癌患者的血浆中发现外泌体表达免疫抑制因子如IL-10和TGF-β1促进TReg细胞功能，削弱抗肿瘤免疫[37]。证明外泌体能够影响抗肿瘤反应的关键免疫细胞功能。中医理论认为，正气抵御邪气的能力与免疫系统防御、自稳、监视的特性相似[38]。在瘀毒、邪气和机体正气交锋中，机体脏腑气血平衡被打破致正气日渐虚损，而瘀毒进一步加重，以此循环往复。外泌体携带免疫抑制因子抑制免疫应答，两者均可通过降低机体免疫力影响肿瘤生长。外泌体可作为黏附的载体分子和细胞表面固定的蛋白酶，可以模拟肿瘤微环境中的ECM，有利于卵巢癌转移。例如，来自卵巢癌腹水的外泌体被证明为L1-CAM裂解的平台[39]。类似地，EpCAM和CD24在卵巢癌中过表达，释放在体外培养细胞系和恶性腹水中的外泌体含有基质的明胶溶解酶金属蛋白酶家族[40]。瘀毒等致病因子随气升降,破坏络脉、胞宫微环境，并随经络走形游窜各处，造成侵袭与转移。这与外泌体破坏微环境并促使转移相类似。总的来说，在卵巢癌发生和转移中，外泌体的病理功能与瘀毒伤络之间存在紧密的动态联系，外泌体可能是肿瘤与微环境之间的重要媒介。

中医理论认为，瘀毒伤络为卵巢癌的中医病机之关键，以瘀毒作为信使引起外泌体的异常调控，是卵巢癌的发生、发展及转移的重要因素。外泌体通过运送核酸、蛋白质和脂质等物质进行细胞之间的物质交换，介导信息传递，这正是中医络脉理论的微观投射。而病理性外泌体通过影响肿瘤的微环境，进而促进卵巢癌发生、转移及复发。同样，瘀毒作为致病因素，结聚于胞宫络脉，滞碍脏腑经络气血运行，导致脏腑经络失养；瘀毒通过胞宫络脉网状系统周流全身，瘀毒蓄积不仅损伤络脉循环体系，使病变范围扩散，还会伴随着微观物质的改变，而外泌体可被当作这些微观物质。由此可见，瘀毒符合外泌体参与致病的生物学特性。瘀毒作为病理状态下的外泌体，借经络之道，使脏腑胞宫发生相应病理改变，机体的微生态系统亦随之改变，从而影响着肿瘤细胞的微环境，促进卵巢癌的发生发展及转移。外泌体可为脏腑胞宫联结的物质基础，瘀毒等病理产物乃是病理性外泌体携带的信息媒介。因此，卵巢癌外泌体作为使者，影响邻近区域或远处细胞的恶性生物学行为以及卵巢癌微环境的病理状态；而“瘀毒伤络”是破坏机体络脉体系的微生态系统的病理现象，二者存在着一定的联系性及相关性。

5 思考与展望

根据“瘀毒伤络”理论与外泌体相关性，发现外泌体在卵巢癌及其微环境中作用，并与瘀毒伤络存在一定的相关性，说明可以从微观角度出发，通过外泌体来探讨“瘀毒伤络”理论防治卵巢癌的科学性。鉴于外泌体参与肿瘤侵袭、转移、免疫诸多环节，而中医药通过多环节、多通路、多靶点的特性防治肿瘤，因此可考虑将中医药直接作用于肿瘤来源的外泌体或通过外泌体负载中药单体或中药复方发挥治疗作用。希望将现代分子生物学技术与中医经典理论相结合，以赋予中医理论可行性及可信性的内涵，为疾病的防治提供新的思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。