痰湿内阻慢性失眠大鼠模型建立及半夏秫米汤基于HPA轴、炎症因子的治疗机制

张艳，杨嫚，刘西建，张喆，李琳，辛丹

1 山东中医药大学，济南 250355；2 山东省委党校燕山校区卫生所

据报道，5%～10%的成年人患有慢性失眠［1］。随着现代生活节奏的不断加快，其患病率呈逐年上升及低龄化趋势。慢性失眠不仅严重影响人们的工作和生活，而且与心脑血管疾病、糖尿病、精神疾病的发生密切相关［2-4］。截至目前，慢性失眠仍缺乏行之有效的治疗方法，药物治疗是其主要的治疗方法［5］。苯二氮䓬类、非苯二氮䓬类、褪黑素受体激动剂等是临床常用药物，但往往会产生耐药、戒断、心理及躯体依赖、记忆力受损等不良反应［6］。始载于《黄帝内经》的半夏秫米汤，为临床治疗失眠的基础方，尤宜于痰湿内阻慢性失眠。既往研究证实，该方具有镇静催眠作用［7］，但作用机制并未完全阐明。下丘脑—垂体—肾上腺（HPA）轴失调是慢性失眠神经生物学因素之一［8］。2018 年10 月—2020 年1 月，我们探讨了痰湿内阻慢性失眠大鼠模型的建立方法，并基于HPA 轴及炎症因子变化探讨了半夏秫米汤干预痰湿内阻慢性失眠的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：SPF 级雄性Wistar 大鼠，6 周龄，体质量（200 ± 20）g，48 只，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SYXK（鲁）2014007。饲养条件：12 h/12 h明暗交替，室温（22±2）℃，相对湿度40%～60%。药物：半夏秫米汤组成：半夏五合（60 g）秫米1 升（120 g）。生半夏购于郑州瑞龙制药股份有限公司，秫米购于山东鹤来香食品有限公司，经山东中医药大学中药鉴定室刘红燕老师鉴定，生半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit. 的干燥块茎，秫米为禾本科植物高粱Sorghum vulgarePers 的种仁。二药加6 倍体积冷水浸泡1 h，加热煮沸后煎煮1 h，减压低温40 ℃浓缩，浓缩至浓度为1.5 g/mL生药水煎液，置于4 ℃冰箱避光保存备用。试剂及仪器：戊巴比妥钠购于北京普博斯生物科技有限公司；地西泮片购于山东信宜制药有限公司；固态猪油（自制）。肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素4（IL-4）、IL-10、白细胞介素1β（IL-1β）、γ 氨基丁酸（GABA）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）、大鼠促肾上皮质激素释放激素（CRH）ELISA 试剂盒购于江苏晶美生物科技有限公司。全自动化学发光分析仪（型号：Tanon-5200）购于上海天能科技有限公司；台式高速低温离心机（型号：JW-3021HR）购于安徽嘉文仪器设备有限公司；隔水式恒温培养箱（型号：GNP-908）购于上海精宏实验设备有限公司；酶标仪（型号：352 型）；单平台水环境：大鼠箱（型号：R1，规格：460 mm×300 mm×160 mm），内置1 直径为80 mm，高90 mm，厚15 mm的平台，水面距平台约10 mm。

1.2 痰湿内阻慢性失眠大鼠模型制备 采用随机数字表法将大鼠分成6组：空白组、痰湿内阻慢性失眠组及半夏秫米汤低、中、高剂量组和地西泮组，每组8 只。除空白组外，其余5 组均给予高脂饲料［9］+猪油3 mL 灌胃/只/天，连续10 周，并于第8 周采用单平台水环境法，每天自13：00 至次日9：00 剥夺睡眠，连续21 d，制备痰湿内阻慢性失眠大鼠模型。动物昼夜节律消失，对周围声音、光刺激敏感，易激惹，兴奋性增高，睡眠潜伏期和睡眠持续时间与空白组相比差异有统计学意义；体质量增加，呈腹部肥胖状态，精神萎靡不振，毛色萎黄黯淡，活动度下降，饮食减少，便溏，肛周不洁，舌黯红，苔白厚腻，符合中医“痰湿证”特点，血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）较空白组升高，高密度脂蛋白（HDL-C）降低，差异有统计学意义，则造模成功。造模成功后，各给药组按照人鼠剂量换算（根据60 kg 成人临床剂量，生半夏15 g、秫米30 g，生半夏30 g、秫米60 g，生半夏60 g、秫米120 g，地西泮片5 mg），半夏秫米汤低、中、高剂量组按4.69、9.38、18.75 g/kg灌胃给予半夏秫米汤水煎液，地西泮组按0.75 mg/kg 灌胃给予地西泮水溶液，痰湿内阻慢性失眠组及空白组灌胃给予1 mL/100 g 生理盐水，每日1次，连续14 d。

1.3 动物体征及行为学变化 观察并记录动物体征，如体质量、活动、毛色、饮食等变化。

1.4 血脂检测 第7 周后，乙醚气体麻醉，各组大鼠内眦取血，常温离心后取血清，置于-80 ℃冰箱，全自动生化仪检测血清TG、TC、LDL-C、HDL-C。

1.5 睡眠潜伏期和睡眠持续时间测定 第10 周后，在预实验基础上，痰湿内阻慢性失眠组大鼠与空白组大鼠按照90 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠溶液，记录睡眠潜伏期及睡眠持续时间。

1.6 血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA 测定 末次灌胃后禁食24 h，乙醚气体麻醉，各组大鼠内眦取血，常温离心后取上清，置-80 ℃冰箱，用ELISA 法检测血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA，按照试剂盒说明书操作。

1.7 下丘脑IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 测定 末次灌胃后禁食24 h，取血后，断头，冰上迅速剥离大脑，取出下丘脑，置于-80 ℃冰箱，用ELISA 法检测下丘脑IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10，按照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用-x±s表示，比较采用t检验；多组间比较采用One-way-ANOVA 方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物体征及行为学变化 实验第2 周，与空白组相比，痰湿内阻慢性失眠组大鼠大便黏腻，肛周不洁；第5周时空白组、痰湿内阻慢性失眠组大鼠体质量分别为（259.26±34.48）、（263.74±29.82）g，第7周时分别为（257.23±23.15）、（272.90±32.05）g，第5周、第7周痰湿内阻慢性失眠组大鼠体质量大于空白组，腹部肥胖，精神萎靡不振，毛色萎黄黯淡，活动度下降，饮食减少，便溏，舌黯红，苔白厚腻，符合中医“痰湿证”特征。实验第10周，昼夜节律消失，对周围声音、光刺激敏感，易激惹，兴奋性增高，符合失眠特征。

2.2 痰湿内阻慢性失眠组与空白组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较 见表1。

表1 痰湿内阻慢性失眠组与空白组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较（mmol/L，-x±s）

2.3 痰湿内阻慢性失眠组与空白组睡眠潜伏期和睡眠持续时间比较 10周后，痰湿内阻慢性失眠组与空白组睡眠潜伏期分别为（20.87 ± 3.97）、（11.11 ±3.65）min，睡眠持续时间分别为（41.43 ± 10.11）、（65.89±21.61）min。与空白组比较，痰湿内阻慢性失眠组睡眠潜伏期延长，睡眠持续时间缩短（P均＜0.05）。

2.4 各组大鼠血清ACTH、CORT、CRH、GABA、NE、DA水平比较 见表2。

表2 各组大鼠血清ACTH、CORT、CRH水平比较（-x±s）

2.5 各组大鼠下丘脑IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 含量比较 见表3。

表3 各组大鼠下丘脑IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10含量比较（-x±s）

3 讨论

中医认为，痰湿内阻是慢性失眠难以治愈的主要原因之一。半夏秫米汤化痰通利、引阳入阴安神，有“失眠第一方”之美称。方中半夏燥湿化痰而安神，秫米能健脾止泻，化痰安神。

构建中医证候特点的失眠动物模型，是防治失眠的重要环节［10］。截至目前，尚未见痰湿内阻失眠大鼠模型的报道。本研究首次采用高脂饲料+单平台水环境法复制痰湿内阻慢性失眠模型，结果证实该方法可行。造模后模型大鼠符合中医“痰湿证”特点，同时符合慢性失眠模型标准。

HPA 轴是调控机体应激反应的神经内分泌系统，HPA 轴功能亢进是引起慢性失眠的重要因素。HPA 轴的激活和CRH 的分泌增加，使促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）浓度增加，产生觉醒效应［11］。本实验中模型大鼠在睡眠剥夺后，处于应激状态，呈现HPA 轴亢进，ACTH、CORT、CRH 分泌增多，给予半夏秫米汤后，ACTH、CORT、CRH 降低，表明半夏秫米汤对兴奋的HPA 轴有抑制作用，从而调节睡眠，尤以半夏秫米汤高剂量组效果最好。

炎症因子不仅调节免疫，而且调节睡眠，是近几年失眠研究的热点之一。一般认为，TNF-α和IL-1β是促眠因子［12］。IL-4、IL-10 可抑制睡眠［13］。而且TNF-α 和IL-1 还可以激活HPA 轴［14］。本研究中，模型大鼠在睡眠剥夺后，反馈性地使促眠因子TNF-α、IL-1β 升高，抑制睡眠的IL-4、IL-10 降低，而且TNFα、IL-1β的升高可能还会激活HPA 轴。给予半夏秫米汤后，TNF-α、IL-1β 降低，IL-4、IL-10 升高，表明半夏秫米汤可能通过调控炎症因子而抑制亢进的HPA轴调节睡眠，尤以高剂量效果最好。

睡眠受到多种中枢神经递质调节，如γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）等。GABA 是脑内主要的抑制性氨基酸类递质［15］。DA、NE是与觉醒有关的神经递质。本实验中，模型大鼠血清GABA、DA、NE 升高，给予半夏秫米汤后，上述指标均降低，表明半夏秫米汤通过抑制上述神经递质含量而干预睡眠，尤以半夏秫米汤高剂量组效果最好。

综上所述，高脂饮食+单平台水环境法复制痰湿内阻慢性失眠大鼠模型可行。半夏秫米汤可通过抑制亢进的HPA 轴、调控IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10、GABA、NE、DA 表达而干预痰湿内阻慢性失眠，以半夏秫米汤高剂量（原方剂量）效果最佳。