敲低DR5表达对rmhTRAIL联合5-FU干预结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

孙同友，周硕，梁秀军，武慧杰，廉蕊

1 承德市中心医院放化疗科，河北 承德 067000；2 承德医学院研究生院；3 承德医学院基础医学研究所

结直肠癌（CRC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，每年有超过60 万人死于CRC［1］。5-氟尿嘧啶（5-FU）一直是中晚期CRC 的化疗用药，但肿瘤细胞耐药和不良反应在一定程度上限制了5-FU 应用。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）通过与死亡受体结合选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织和细胞无明显毒性［2］。但系统注射后，TRAIL 的半衰期过短［3］。此外，约50%的肿瘤细胞株对TRAIL不敏感，从而限制了TRAIL 的临床应用。重组变构人TRAIL（mhTRAIL）是由野生型TRAIL变构优化而来，其性能更优［4］。我们课题组前期研究结果显示，rmhTRAIL 与5-FU联合在CRC中显示出良好抗肿瘤作用，5-FU 能够通过上调HCT116 细胞表面死亡受体5（DR5）表达增强rmhTRAIL 的敏感性［5］。TRAIL受体包括DR4、DR5、诱骗受体1（DcR1）、DcR2 和一个被称为骨保护素（OPG）的可溶性受体［5］，DR5 作为TRAIL 的特异性受体之一，具有传导凋亡信号引起细胞凋亡的功能。为了明确DR5 对rmhTRAIL 以及其与5-FU 联合抗肿瘤的重要性，本研究选用人CRC细胞HCT116，观察敲低DR5表达后，rmhTRAIL单药及其与5-FU 联用对细胞增殖及凋亡的影响，以及对凋亡信号通路中相关蛋白表达的影响，进一步阐明其抗结直肠癌作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 rmhTRAIL由北京沙东生物技术有限公司馈赠；5-FU 购自上海旭东海普药业有限公司；人CRC 细胞HCT116 由美国哥伦比亚大学惠赠；流式细胞Annexin VFITC/PI 双染凋亡检测试剂盒（联科生物技术股份有限公司）；MTS（美国Promega公司）；鼠抗Caspase-3 单克隆抗体、鼠抗Caspase-8 单克隆抗体、兔抗DR5 抗体、兔抗Caspase-9 抗体、鼠抗βactin 抗体（美国CST 公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（美国Proteintech Group 公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierces 公司）；1640 培养液（Gibco）、PBS 缓冲液（HyClone）；FBS（胎牛血清，Gibco）、0.25%含EDTA胰酶（Sigma）。DR5 shRNA 质粒、Control shRNA 质粒（美国Santa Cruz公司）；嘌呤霉素（美国Santa Cruz公司）。

1.2 细胞培养 人CRC 细胞HCT116，为单层贴壁生长细胞，用完全1640 培养基培养。将HCT116 细胞置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内进行培养，隔2～3 d传代1次，细胞消化液为含EDTA的0.25%胰酶溶液。

1.3 质粒转染 选取处于对数期生长的HCT116细胞，按浓度2×105/mL 接种于35 mm 培养皿中，分为空白对照组、Control shRNA 组和DR5 shRNA 组，按照转染试剂说明书进行转染，转染48 h后，用含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基进行抗性筛选，最终选取2µg/mL嘌呤霉素作为稳定转染细胞的筛选浓度。当转染细胞融合度达80%时，将细胞消化转入培养瓶中进行扩大培养，将稳定转染的细胞分别命名为HCT116/Control shRNA（HCT116/Con）细胞和HCT116/DR5 shRNA（HCT116/KD）细胞。Western blotting法验证敲低效果。

1.4 细胞增殖检测 采用MTS 法。①rmhTRAIL或5-FU 单药对细胞增殖的影响：将处于对数生长期的HCT116/Con 细胞和HCT116/KD 细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，分别按5 000/孔接种于96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。5-FU 的作用浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、50、100 µg/mL；rmhTRAIL 的作用浓度分别为1.25、2.5、5、10、50、100 ng/mL，每个浓度均设3 个复孔。作用48 h 后，吸除孔内原培养液，避光条件下加入配制好的MTS溶液，120µL/孔，然后将细胞放入恒温培养箱中继续避光培养3 h，利用酶标仪检测490 nm 波长处各孔的OD 值。根据细胞的生长抑制率分别计算rmhTRAIL 和5-FU 单药处理细胞48 h 时的半数抑制浓度（IC50）。②rmhTRAIL 联合5-FU 对细胞增殖的影响：将HCT116/Con 和HCT116/KD 细胞经胰酶消化后接种于35 mm培养皿中，过夜贴壁后，分为对照组、5-FU 组、rmhTRAIL 组、rmhTRAIL+5-FU 组，根据IC50 值选取5-FU 的浓度为5 µg/mL，rmhTRAIL 的浓度为10 ng/mL，药物处理细胞48 h，MTS法检测细胞增殖情况，方法同上。细胞生长抑制率（%）=（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD 值×100%。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测 将HCT116/Con和HCT116/KD细胞经胰酶消化后接种于35 mm 培养皿中，过夜贴壁后，分为对照组、5-FU 组、rmhTRAIL 组、rmhTRAIL+5-FU 组，5-FU 的浓度为5 µg/mL，rmhTRAIL的浓度为10 ng/mL，药物处理48 h。按照Annexin V-PFITC/PI 双染流式细胞凋亡检测试剂盒说明书对各组细胞处理后染色，流式细胞仪（BD FACSCalibur）测算各组细胞凋亡率，实验重复3 次统计结果。

1.6 凋亡通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法。将HCT116/KD 细胞分为对照组、5-FU组、rmhTRAIL 组、rmhTRAIL+5-FU 组，药物作用48 h后，PBS 清洗，加入RIPA 裂解液（美国Thermo 公司）充分反应，冰上收取裂解液，12 000 r/min 离心20 min（离心半径10 cm），小心吸取上清，按照BCA蛋白定量试剂盒（中国索莱宝科技有限公司）步骤进行定量，计算总蛋白浓度，加入Loding蛋白变性后进行垂直凝胶电泳，转膜，封闭，4 ℃湿盒内一抗孵育过夜（一抗的稀释浓度：DR5、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP按1∶1 000稀释，β-actin按1∶2 000稀释），第2 天加二抗（1∶5 000，中国碧云天生物技术有限公司）室温孵育1.5 h，ECL 发光显影，用全自动化学发光成像分析系统曝光扫描，应用Image J软件对蛋白条带进行分析、测量灰度值，实验重复3 次。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。符合正态分布计量资料以-x±s表示，两组间比较采用两样本均数t检验，多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DR5蛋白在稳定转染细胞株中的表达 HCT116、HCT116/Con、HCT116/KD 细胞中DR5 的相对表达量分别为1.01 ± 0.16、0.86 ± 0.17、0.04 ± 0.00，HCT116/KD 细胞中DR5 表达低于HCT116 亲本株和HCT116/Con 细胞，且敲低效果达90%以上，差异有统计学意义（P均＜0.05）。证实敲低DR5 表达的稳定转染细胞株构建成功。

2.2 敲低DR5 表达对CRC 细胞药物敏感性的影响

2.2.1 敲低DR5 表达后rmhTRAIL 及5-FU 单药对CRC 细胞增殖的影响 不同浓度的rmhTRAIL 作用于细胞时，在各浓度组，HCT116/KD细胞的生长抑制率低于HCT116/Con 细胞，差异均有统计学意义（P均＜0.05），随着药物浓度升高，细胞生长抑制率增加趋势不如HCT116/Con细胞明显；而单用不同浓度的5-FU 作用于细胞时，在各浓度组，HCT116/KD 细胞与HCT116/Con 细胞的生长抑制率无统计学差异（P均＞0.05）。单药rmhTRAIL 对HCT116/KD 细胞的IC50值高于HCT116/Con 细胞，分别为（65.76 ±4.65）、（5.16±0.12）ng/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）；而单药5-FU 对HCT116/KD 细胞和HCT116/Con细胞的IC50值相比差异无统计学意义（P＞0.05），分别为（6.09±0.12）、（6.13±0.63）ng/mL。见表1、2。

表1 敲低DR5表达后不同浓度5-FU作用于细胞的抑制率比较（%，±s）

表1 敲低DR5表达后不同浓度5-FU作用于细胞的抑制率比较（%，±s）

5-FU（µg/mL）1.25 2.5 5 10 20 50 100细胞抑制率HCT116/Con 13.87±0.99 34.47±1.52 49.29±0.08 58.00±0.76 69.07±0.81 89.07±0.30 94.75±0.23 HCT116/KD 13.76±0.93 32.63±0.49 47.69±0.82 58.45±0.96 69.86±0.34 94.17±0.13 97.26±0.33

2.2.2 rmhTRAIL与5-FU联合作用于CRC HCT116细胞，MTS 结果显示，rmhTRAIL 与5-FU 联合作用于HCT116/KD 细胞的增殖抑制率为（56.70 ±1.33）%，低于HCT116/Con细胞的（78.67±0.94）%，差异有统计学意义（t=23.338，P＜0.01）。

表2 敲低DR5表达后不同浓度rmhTRAIL作用于细胞的抑制率比较（%，±s）

表2 敲低DR5表达后不同浓度rmhTRAIL作用于细胞的抑制率比较（%，±s）

注：与HCT116/Con相比，▼P＜0.01。

rmhTRAIL（µg/mL）1.25 2.5 5 10 50 100细胞抑制率HCT116/Con 10.50±0.49 35.68±1.10 49.29±0.08 63.87±0.23 81.95±0.41 84.85±0.88 HCT116/KD 6.14±0.78▼12.20±0.45▼16.64±1.21▼22.29±1.16▼46.65±1.01▼56.25±1.65▼

2.3 敲低DR5 表达对CRC 细胞凋亡的影响rmhTRAIL 单药分别作用于HCT116/Con 细胞和HCT116/KD 细胞，凋亡率分别为（62.12 ± 0.32）%和（10.48 ± 1.16）%，差异有统计学意义（t=74.23，P＜0.01）；rmhTRAIL 联合5-FU 分别作用于HCT116/Con细胞和HCT116/KD细胞，凋亡率分别为（85.80±0.0.40）%和（13.33±0.13）%，差异有统计学意义（t=296.379，P＜0.01）。

2.4 敲低DR5 表达对凋亡通路相关蛋白表达的影响 敲低DR5 后，无论是rmhTRAIL 单药，还是rmhTRAIL 与5-FU 联用，HCT116/KD 细胞中Caspase-3、Caspase-9、PARP 蛋白表达无明显下降（P均＞0.05），rmhTRAIL 与5-FU 联合导致Caspase-8 表达略有下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；PARP 蛋白裂解片段表达有所上升，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组稳定转染细胞系中凋亡通路蛋白相对表达量比较（-x±s）

3 讨论

2020 年全球癌症统计数据显示，CRC 的发病率占所有恶性肿瘤发病的第3 位，病死率占第2 位［6］。手术结合放化疗的综合治疗使非转移性CRC 患者的生存获得了稳定改善，尽管如此，仍有超过40%的患者会发生远处转移［7］。抑制肿瘤血管生成在恶性肿瘤的治疗中取得了较好疗效，但是在CRC 中却进展缓慢。近几年，免疫治疗开启了恶性肿瘤治疗的新篇章，在有MSI-H/dMMR 的转移性CRC（mCRC）中，免疫治疗的疗效较化疗或化疗联合靶向治疗显著提高［8］，然而，仅有约5%的mCRC 患者表现为MSI-H/dMMR，而不伴有MSI-H/dMMR的mCRC 对免疫治疗反应性仍较差，因此，寻找新的有效治疗CRC药物或策略迫在眉睫。

mhTRAIL 是北京沙东生物公司开发并具有独立知识产权的新型制剂，属于Ⅰ类新生物制品，其在溶解性、稳定性、半衰期及安全性方面均优于野生型TRAIL，在基础以及临床试验中均显示出较好抗肿瘤效果［9-10］。目前认为，在哺乳动物中主要存在两条凋亡途径，外源性凋亡途径和内源性凋亡途径，TRAIL 主要通过与其特异性受体DR4 和/或DR5 结合激活外源性凋亡途径而诱导细胞凋亡［11］。在Ⅱ型细胞，外源性凋亡途径激活的Caspase-8可进一步启动内源性凋亡途径来增强TRAIL 诱导细胞凋亡的能力［11-12］。本课题组前期研究结果表明，rmhTRAIL 通过与死亡受体结合导致CRC 细胞发生了Caspase 依赖性凋亡，在HCT116 细胞，5-FU 通过上调DR4 和DR5 的表达增强了rmhTRAIL 诱导细胞凋亡的能力。

DR5 是Ⅰ型跨膜蛋白，具有传导凋亡信号并引起细胞凋亡的功能［13］。有研究显示，在肾癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胃癌中，DR5在TRAIL诱导细胞凋亡中发挥了关键作用［14-16］。为了明确DR5 在rmhTRAIL 诱导CRC 细胞凋亡中是否同样发挥关键作用，本研究应用DR5 shRNA 质粒稳定转染CRC HCT116 细胞，Western blotting 实验验证敲低效果，结果显示成功构建了敲低DR5 的稳定转染细胞株HCT116/KD，转染效率在90%以上。

我们前期实验结果显示，rmhTRAIL单药及其与5-FU 联用能明显抑制亲本株HCT116细胞增殖并诱导其凋亡。本研究敲低DR5表达后，MTS结果显示，rmhTRAIL抑制细胞增殖的作用明显减弱，差异有统计学意义；当rmhTRAIL 联合5-FU作用于细胞时，对HCT116/KD 细胞的生长抑制作用低于HCT116/Con细胞，差异有统计学意义。本研究中流式细胞术结果显示，DR5被敲低后，rmhTRAIL单药或者rmhTRAIL联合5-FU 诱导的细胞凋亡减少，与HCT116/Con 组细胞比较差异有统计学意义。以上结果均表明DR5是rmhTRAIL 抑制HCT116 细胞增殖的基础，且DR5 是rmhTRAIL诱导细胞凋亡的关键蛋白。

Caspase 家族蛋白酶在细胞凋亡过程中发挥了关键作用，是细胞凋亡的中心环节，其参与了凋亡启动、信号传导及刺激凋亡效应的发生等过程［17］。因此本研究采用Western blotting 法检测了凋亡通路中相关蛋白表达变化，试图从分子机制上说明DR5 表达的重要性。结果显示，DR5 被敲低后，无论是rmhTRAIL 单药组还是rmhTRAIL 与5-FU 联用，细胞中Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 及PARP蛋白表达无下降或下降不明显，PARP 蛋白裂解片段表达较对照组表达有所升高，差异有统计学意义，而本课题组前期已发表的实验结果显示，在未敲低DR5 的亲本株HCT116 细胞，rmhTRAIL 单药或rmhTRAIL与5-FU联用均导致Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 及PARP 蛋白表达明显下降，PARP 蛋白裂解片段表达显著上升［5］。表明敲低DR5 表达导致凋亡信号传递受阻，即rmhTRAIL 单药及其与5-FU 联用诱导CRC HCT116 细胞凋亡有赖于DR5表达。

综上所述，本研究采用DR5 shRNA 稳定转染CRC 细胞，成功构建稳定转染细胞系，从细胞水平及分子水平证实，DR5 是rmhTRAIL 单药及其与5-FU 联用诱导细胞凋亡的基础。敲低DR5 表达后rmhTRAIL 单药及其联合5-FU 干预HCT116细胞，细胞增殖受抑减弱，凋亡减少。