麻黄附子细辛汤对阳虚型非小细胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响*

李亮 陈昱丞 王强 周洁

(1.天津中医药大学第二附属医院中医经典病房，天津 300000；2.天津中医药大学第二附属医院肿瘤科，天津 300000)

据世卫组织报道，肺癌是全球癌症死亡的首要原因。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病理分型的80%左右。据中国肿瘤登记中心的统计结果显示，肺癌为中国恶性肿瘤发病率及病死率首位。肺癌已成为威胁公众生命健康安全的严重疾病之一[1]，且大部分肺癌患者确诊已属中晚期，甚至已丧失手术治疗的机会，同时患者难以耐受现代医学放化疗带来的不良反应，因此，采取多学科综合治疗的模式，积极研究中医药治疗手段，以期最大程度的控制肿瘤进展、改善患者生活质量、延长生存时间已成为肿瘤治疗发展的趋势。探寻非小细胞肺癌(NSCLC)的发生、演变规律以及新的治疗手段对提高疗效至关重要。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinasePI3K)/蛋白激酶B(proteinki-naseBPKB，又称Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mam-malian target of rapamycin，MTOR)(PI3K/Akt/mTOR)通路在正常细胞生理条件中，以及病理情况下肿瘤发生转移中均是中枢调节因子。该途径包含3个主要驱动因子：PI3激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。PI3K/Akt/mTOR通路在肿瘤细胞的生长发展、增殖转移等环节中具有重要的作用[2]。我们在长期临床经验中发现麻黄附子细辛汤治疗非小细胞肺癌疗效显著[3]，通过对麻黄附子细辛汤阻断非小细胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路进行实验观察，旨在对麻黄附子细辛汤治疗阳虚型非小细胞肺癌的机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 麻黄附子细辛汤(麻黄12 g，细辛3 g，附子9 g)购自天津中医药大学第二附属医院。按相关文献标准，用蒸馏水稀释至40 mL，分别作为麻黄附子细辛汤低剂量、中剂量、高剂量的灌胃药液，无菌4 ℃保存。灌胃时水浴至约20 ℃使用。注射用顺铂(DDP)，20 mg/支，齐鲁制药有限公司生产，购自天津中医药大学第二附属医院，生理盐水稀释至0.367 mg·mL-1，避光保存。顺铂注射液(齐鲁制药有限公司)，注射用氢化可的松注射液(天津药业集团新郑股份有限公司)。采用含100 U·mL-1青、链霉素、10%灭活胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，水合氯醛(天津科密欧试剂公司)。PI3K p85αpolyclonal antibody、PI3K p110αpolyclonal antibody、Akt polyclonal antibody、Phospho-Akt Rabbit mAb、mTOR polyclonal antibody、Phospho-mTOR Rabbit mAb(Biworld公司)

1.2实验动物 实验动物C57BL/6小鼠70只，雄性，6～8周龄，体质量18～20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，货号：C57BL/6NCrl小鼠SPF级。

1.3方法 采用注射用氢化可的松注射液25 mg·kg-1·d-1肌肉注射制作阳虚型模型，1次·d-1，连续15 d，阳虚型造模16 d后，采用LLC肺癌细胞株传代培养移植法构建小鼠体内肺癌移植瘤模型。接种10 d后，以皮下摸到3～5 mm3的米粒样硬物，待其长至1 cm3左右，每组剥取1只移植瘤行病理检测均为癌细胞，说明造模成功。将荷瘤小鼠随机分为模型组，化疗组，麻黄附子细辛汤高、中、低剂量组(中药高、中、低组)，联合组(麻黄附子细辛汤高剂量组+顺铂)，每组6只。模型组(M)：0.2 mL·10 g-1生理盐水灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射生理盐水0.4 mL；麻黄附子细辛汤高剂量组(MH):80.48 g·kg-1(相当于临床成人日用量的4倍)中药药液灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射生理盐水0.4 mL；麻黄附子细辛汤中剂量组(MM):40.24 g·kg-1(相当于临床成人日用量的2倍)中药药液灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射生理盐水0.4 mL；麻黄附子细辛汤低剂量组(ML):20.12 g·kg-1(相当于临床成人日用量的1倍)中药药液灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射生理盐水0.4 mL；化疗组(C):0.2 mL·10 g-1生理盐水灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射DDP溶液0.4 mL；联合组(CMH):80.48 g·kg-1中药药液灌胃10 d，并分别于第1、3、5 d腹腔注射DDP溶液0.4 mL。

运用Western Blot法检测肿瘤组织PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平。

2 实验结果

2.1模型组、麻黄附子细辛汤低、中、高剂量组相关蛋白表达水平 四组PI3K p85α、PI3K p110α、Akt、p-Akt、mTOR相对表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)；四组p-mTOR蛋白相对表达水平无统计学意义(P=0.102)；以麻黄附子细辛汤高剂量组PI3K p85α的相对表达水平为最低(P<0.008)；以麻黄附子细辛汤高剂量组PI3K p110α的相对表达水平为最低(P<0.008)；与模型组相比，低剂量组Akt蛋白相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组Akt蛋白相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；以麻黄附子细辛汤高剂量组Akt蛋白的相对表达水平为最低。与模型组比较，低剂量组p-Akt相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；与低剂量组相比，高剂量组p-Akt相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)。(表1、图1)

表1 模型组、麻黄附子细辛汤低、中、高剂量组相关蛋白表达水平

图1 模型组、麻黄附子细辛汤高、中、低剂量组相关蛋白表达水平

2.2模型组、化疗组、联合组、麻黄附子细辛汤高剂量组相关蛋白表达水平的影响 四组Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、PI3K p110α相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.05)；四组PI3K p85α蛋白未测得实验数据。与模型组相比，联合组Akt相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；与模型组相比，联合组p-Akt相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；与联合组相比，高剂量组p-Akt相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；与模型组相比，联合组mTOR蛋白相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)。与模型组相比，联合组、麻黄附子细辛汤高剂量组p-mTOR相对表达水平差异均具有统计学意义(P<0.008)；麻黄附子细辛汤高剂量组、联合组对PI3K p110α相对表达水平差异具有统计学意义(P<0.008)。(表2、图2)

表2 模型组、化疗组、联合组、麻黄附子细辛汤高剂量组相关蛋白表达水平

图2 模型组、化疗组、联合组、麻黄附子细辛汤高剂量组相关蛋白表达水平

3 讨论

肺癌(lung cancer)是目前世界上死亡率最高，并且对人类健康与生命构成最大威胁的恶性肿瘤[4]。肺癌分型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌 (small cell lung cancer，SCLC)，NSCLC 5年生存率为16%[5]。随着现代医学的发展，NSCLC的诊疗取得了长足的进步，但因其诊断率低、癌细胞转移迅速、发病机制复杂等病理特点，NSCLC的诊治及预后仍不容乐观。

PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活在恶性肿瘤的发生发展、转移复发中起中枢桥梁作用，并与PI3K下游靶蛋白Akt持续活化传导密切相关。据报道[6]，I型PI3K激活细胞表面受体，通过G蛋白受体、酪氨酸激酶受体将信号进行传递，p110和p85构成IA型PI3K，p110和Ras直接结合激活PI3K；或与磷酸化酪氨酸残基结构结合，引起二聚体改变而被激活。PI3K活化后磷酸化生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phos-phatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)并与Akt的PH结构域(pleckstrin homology domain)结合导致Akt蛋白移位；并磷酸化苏氨酸308(Thr-308)位点和疏水区丝氨酸473(Ser-473)位点活化Akt蛋白[7]。Akt作为PI3K下游的靶蛋白，其磷酸化磷酸肌醇脂依赖性蛋白激酶(phosphoinostide dependent protein kinase，PDK)可促使通路活化。另一方面，PI3Kp85α作为IA型PI3K/Akt通路激活的始动环节，磷酸化酪氨酸残基，激活PI3K[8]。同时，PI3Kp85α作为独立信号分子可调节PI3K的活性影响该通路的信号传导，进而调控肿瘤的进展[9]。而且，PI3Kp85α能够抑制p110的持续活化，其发生突变后丧失其抑制作用，使p110持续活化，导致细胞癌变[10]。PI3K/Akt通路可激活下游核糖体蛋白及mTOR，重新构建肌动蛋白，加快肿瘤细胞的扩散转移，增强侵袭性[11]。

中医古籍中并无“肺癌”之病名，肺癌可归类为“肺积”，“息贲”，“肺岩”，“肺胀”，“痰饮”等范畴。《难经·五十五难》曰：“积者，阴气也，其始发有常处，其痛不离其部，上下有所终始，左右有所穷处”，即积者属阴，发病部位固定; 《灵枢·百病始生》有“积之所生，得寒乃生，厥乃成积也”的论述，均强调肿瘤多为阴邪致病。而肾阳是脏腑阴阳的根本，对机体脏腑组织器官具有推动、温煦作用；肿瘤病变，日久累及肾阳，涉及肺脾，早期主要以肾精不足为主，中晚期以肾阳亏虚为突出表现。可见阳虚为肿瘤形成的根本，寒凝痰聚于经络脏腑，为肿瘤形成提供内环境[12-14]。

因此从阳虚论治肺癌有一定的理论及临床实践基础，值得进一步探讨。

在临床工作中，本课题组对脾肾阳虚致肺癌的机理形成了独到的见解。肺癌的发病与肺脾肾三脏功能失调及水液输布异常密切相关。麻黄附子细辛汤，源于《伤寒论》，原文第301条：“少阴病，始得之，反发热，脉沉者，麻黄细辛附子汤主之。”此条阐释少阴病寒化兼表的辨证施治。方中，麻黄发汗解表，宣肺平喘，利水消肿，亦具散寒通滞之功；附子回阳救逆，补火助阳，散寒止痛；附子可上助心阳，中温脾阳，下补肾阳。细辛解表散寒，祛风止痛，通窍，温肺化饮，细辛入肺散在表之寒，又入肾除入里之寒。

在对单药的研究中，三药[15-18]均可抑制肿瘤细胞；尤其附子可提高大鼠自然杀伤细胞的数量，可发挥机体自身的抗肿瘤活性，起到类似于免疫细胞的作用。同时，三药合方[19-21]亦可起到抑制肿瘤细胞的作用。王中奇[19]认为阳虚为肺癌发病的根本，临床运用“温散宣通”之麻黄附子细辛汤治疗非小细胞肺癌，肿块较前缩小，胸腔积液较前几乎全部吸收，无明显喘咳胸闷气急，临床效果显著。在对肺癌并发症的治疗中，朱芳[22]对肺癌疼痛感强烈患者予以麻黄附子细辛汤治疗后，疼痛情况有所缓解。

本实验从整体药效方面探讨麻黄附子细辛汤阻断阳虚型非小细胞肺癌小鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的机制，研究发现麻黄附子细辛汤可一定程度上减弱PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达水平，对PI3K/Akt/mTOR信号通路的传导具备一定的抑制功效。

本实验有部分蛋白表达未测得实验数据，部分蛋白实验显示无统计学差异，考虑与麻黄附子细辛汤煎煮浓度太低，导致药物浓度过低相关；同时下一步可研究麻黄附子细辛汤与PD-1/PD-L1通路的关系，进一步探讨麻黄附子细辛汤抑瘤的分子机制。