复方参柏煎剂对慢性湿疹ICR小鼠的疗效及作用机制*

赵金莉 钟琪 李长香 邢洪霞 赵琰 屈会化 孔慧**)

(1.北京中医药大学 中医学院，北京 100029；2.曲阜市中医院，曲阜 273100；3.北京中医药大学 北京中医药研究院，北京 100029)

湿疹为临床常见疾病之一，且多顽固难愈，近年来湿疹的发病率不断上升，有流行病学调查显示，近二十年来我国皮肤科门诊就诊的患者不断增加，一般人群的湿疹患病率已经接近西方国家，儿童发病率10～30%[1]。目前西医治疗以抗炎、调节免疫、止痒为主，多采用高效外用皮质类固醇，钙调神经酶抑制剂(他克莫司、吡美莫司)，口服抗组胺药、免疫抑制剂、环孢素、生物制剂等，短期内可改善瘙痒和皮损症状，但疗效具有局限性，重复使用这些药物或者长时间使用可能会导致感染，肾上腺抑制，皮肤萎缩，色素沉着发暗，很难恢复，影响视觉，愈合易复发，疗效不确切，难以控制其复发等副作用[2]。中医采用辨证论治的方法治疗湿疹，可有效减少复发，副作用相对较少[3]。

中医古籍文献中无湿疹病名，但有很多关于湿疹的记载，根据其临床特征，将其归于“浸淫疮”“湿疮”等范畴。《诸病源候论·浸淫疮候》记载“小儿五脏有热，熏发皮肤，外为风湿所折，湿热相搏身体，其疮初出甚小，后有脓汁，浸淫渐大，故谓之浸淫疮也”。中医学认为，湿疹发病的原因有内因和外因共同作用而成，内因是体内五脏有热(功能失调)，尤以脾、肺、心三脏为主，外因是感受风、湿、热等六淫邪气，内外两邪相搏，充于腠理，外搏肌肤而发病[4]。

现代医家采用不同的辨证分型，并无统一标准。王庆国教授将湿疹分为血分热毒型、湿热在表型、风湿热盛型、血虚风燥型。治疗急性湿疹突出血分热毒的病理因素，治以凉血清热解毒为主，佐以利湿祛风止痒。对于慢性湿疹，王老师则特别重视养血活血药的应用。针对儿童口服中药比较困难的情况，结合王老师临床治疗经验，拟定了治疗儿童湿疹的外用煎剂[5]。处方组成：本处方由苦参、炒黄柏、蛇蜕、徐长卿、炒槐花、炒刺蒺藜、赤芍、大黄、黄芪、花椒10味中药组成，将其命名为复方参柏煎剂。方中苦参、黄柏清热燥湿为君药；槐花清泻肝火为臣药；徐长卿祛风化湿为臣药；蛇蜕、刺蒺藜和花椒祛风止痒为佐药；赤芍养血润燥、黄芪益气固表兼强脾胃，为佐药；大黄活血祛瘀为使药。全方配伍精当，内健机体(提高机体免疫力)外除病邪(祛湿止痒)，共奏清热燥湿、祛风止痒、养血润燥之功。从外观可见缓解瘙痒、改善皮损的症状。

以复方参柏煎剂外用治疗小儿湿疹、丘疹性荨麻疹、尿布皮炎、足癣、带状疱疹等皮肤疾患，均取得了满意的疗效。本方适用范围广泛、疗效确切，为了造福更广泛的儿童患者，拟将其开发成使用方便的外用制剂，为此，本实验选择慢性湿疹的经典动物模型，评价其效果，并对其作用机制进行初步探讨。

1 实验材料

1.1实验动物 SPF级ICR小鼠，雄性，体重20～25 g(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006)，实验开始前，所有小鼠均适应性饲养在同一环境下，温度为(24.0±1.0)℃，相对湿度为(55～65)%，可自由饮食进水，12 h～12 h明暗循环饲养，在实验前12 h，禁食不禁水。

1.2实验药物 复方醋酸地塞米松乳膏(华润三九医药股份有限公司，国药准字H44024170)；复方参柏煎剂：按处方比例称取苦参、炒黄柏、蛇蜕、徐长卿、炒槐花、刺蒺藜、赤芍、大黄、黄芪、花椒,加水煎煮(加水八倍量，浸泡2 h，煎煮二次，每次40 min，两次水煎液合并)，滤液浓缩至0.64 g/mL(按生药计)(中药饮片均购自北京仟草中药饮片有限公司)。

1.3实验试剂 2,4-二硝基氯苯(DNCB)(阿法埃莎(中国)化学有限公司)；无水乙醇(北京化工)；4%组织细胞固定液(北京百瑞极生物科技有限公司)；1×PBS缓冲液(深圳瑞捷特科技有限公司)；薇婷脱毛膏(利洁时家化(中国)有限公司)；小鼠IL-4、干扰素-γ、IL-17试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)。

1.4实验设备 分析天平(BSA1245-CW，0.1 mg，德国Sartorius)；螺旋测微器(0～25 mm，苏州英仕精密机械有限公司)；手持组织匀浆机(上海净信实业发展有限公司)；打孔器(得力文具)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1复方参柏煎剂对慢性湿疹小鼠模型的药效学研究 取42只ICR雄性小鼠，随机分为6组：空白组、模型组、阳性药对照组(复方醋酸地塞米松乳膏组)、复方参柏煎剂低剂量(0.16 g·mL-1，以原药材计)组、中剂量(0.32 g·mL-1)组、高剂量组(0.64 g·mL-1)，每组7只，腹部脱毛(面积2 cm×2 cm)，以7%的DNBC乙醇溶液100 μL/只涂擦致敏，间隔5天，第6天以1%的DNCB乙醇溶液10 μL/只涂擦右耳部激发，隔一天激发一次，共激发4次，药物干预从第一次激发的第二天开始，涂擦右耳部给药，阳性药组10 μL/只，复方参柏煎剂组10 μL/只，一天两次，激发当天不给药，模型组给予等量生理盐水处理，末次给药后观察小鼠耳部红肿及鳞屑情况，次日再次给药后，摘眼球取血，脱臼处死，并取各组小鼠耳朵，比较左右耳重量及厚度差，取部分耳片组织放于4%组织细胞固定液中固定，剩余耳朵组织液氮冻存后放入-80 ℃冰箱中备用。

2.2指标检测方法

2.2.1耳重量及厚度测量 沿小鼠耳朵根部剪取小鼠双耳，用螺旋测微器测量双耳同一位置的厚度，多次测量取平均值；随后用打孔器(孔洞直径0.35 cm)切取双耳中部相同位置的组织，分析天平称取其重量。

2.2.2小鼠耳朵组织切片 剪取小鼠右耳部分组织，放于4%组织细胞固定液中固定，石蜡包埋，HE染色，电子显微镜200倍下观察、拍片。

2.2.3ELISA法检测相关指标 末次给药后摘眼球取血，随后脱臼处死小鼠，血液静置两小时后，3000 r·min-1离心15 min，取上层血清，按照ELISA试剂盒的操作方法，检测血清中IL-4、IFN-γ和IL-17的含量。

取冻存的耳朵组织，用生理盐水漂洗，擦干并称重，之后加入9倍量1×PBS缓冲液，组织匀浆机研磨，3000 r·min-1离心15 min，取上清液，按照ELISA试剂盒的操作方法,检测小鼠耳组织匀浆中IL-4和IL-17的含量。

3 实验结果

3.1组织形态学观察 复方参柏煎剂外用治疗小鼠耳肿胀的组织形态学实验结果见图1，从图中可以看出，空白组小鼠耳朵HE染色切片中表皮层、真皮层组织结构完好，层次分明，厚度适中；与空白组相比，模型组表现为表皮角化不全，颗粒层及棘层增厚，且有大量炎性细胞浸润；其它各治疗组亦有表皮角化过度或不全，颗粒层及棘层增厚，炎性细胞浸润的病理表现，但均较模型组轻。表明复方参柏煎剂可以明显改善小鼠耳朵的炎性症状。

3.2复方参柏煎剂对小鼠耳肿胀的影响 复方参柏煎剂对小鼠耳厚度及耳重量的测定结果见表1。从表中可以看出，与空白组比较，模型组小鼠耳厚度明显增加，具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，阳性药对照组耳厚度显著降低(P<0.01)；与模型组相比，复方参柏煎剂低剂量组耳厚度降低，具有显著差异(P<0.05)，中、高剂量组具有极显著差异(P<0.01)。与空白组比较，模型组小鼠耳重量增加，具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，阳性药对照组耳重量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，复方参柏煎剂中、高剂量组小鼠耳重量降低，具有极显著差异(P<0.01)，低剂量组耳重量也降低了，但是差异未达到显著性。以上结果表明，复方参柏煎剂可以明显改善小鼠的耳肿胀度，且具有一定的剂量依赖性。

图1 复方参柏煎剂外用治疗小鼠耳肿胀的组织形态学实验结果

表1 各组小鼠耳厚度及耳重量比较

3.3复方参柏煎剂的作用机制研究 复方参柏煎剂对小鼠血清IL-4、IFN-γ及IL-17因子的影响见表2。由表2可知，与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-4上升、IFN-γ下降，且均具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，阳性药对照组及复方参柏煎剂低、中、高剂量组血清IL-4的含量降低，均具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，阳性药对照组及复方参柏煎剂中、高剂量组血清IFN-γ的含量升高，具有极显著差异(P<0.01)，低剂量组具有显著差异(P<0.05)。各组血清IL-17含量均低于试剂盒检测下限，此项未获得有效数据。

表2 各组血清IL-4、IFN-γ及IL-17比较

由于实验中各组血清IL-17含量均低于试剂盒检测下限，所以增测了组织(耳朵)中IL-17含量，另外IL-4的测定值也比较低，故在组织中一起增测了IL-4的含量，结果见表3。由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠组织中IL-4、IL-17含量上升，且均具有极显著差异(P<0.01)；与模型组相比，阳性药对照组及复方参柏煎剂高剂量小鼠组织中IL-4含量均极显著下降(P<0.01)，中剂量组显著下降(P<0.05)，低剂量组无显著差异。与模型组相比，阳性药对照组和复方参柏煎剂低、中、高剂量组小鼠组织中IL-17含量均极显著下降(P<0.01)，且呈现一定的剂量依赖性。

由以上结果可知，复方参柏煎剂小鼠组织中IL-4的含量变化趋势与血清中的一致，与模型组相比均呈降低趋势；复方参柏煎剂各剂量组的IL-17含量均比模型组显著降低，说明本品可以通过降低IL-4和IL-17含量来达到降低炎症反应的作用。

表3 各组组织IL-4、及IL-17比较

4 讨论

中医学认为，邪之所入便是邪之所出，湿疹表现为皮毛受病，应从皮毛而解。中医遵循“外治之理，即内治之理，外治之药即内治之药”。临床上湿疹多内外合治，口服中药汤剂与中药液擦拭浸泡患处相结合，能够起到更好的效果。考虑到儿童患湿疹的比率比较大，而且服用中药比较困难，所以有必要研制适用儿童的疗效确切的湿疹外用制剂。

4.1复方参柏煎剂处方分析 湿疹是由内外因素共同作用而成的，内因以脾湿为主，外因以风、湿、热为主，总不离乎“湿”[6]，复方参柏煎剂由苦参、炒黄柏、蛇蜕、徐长卿、炒槐花、炒刺蒺藜、赤芍、大黄、黄芪、花椒组成。方中黄柏、槐花、刺蒺藜均用炒制品是本处方的点睛之笔，因湿疹不离“湿”，炒制增加了其“火”性，又“火”能胜“湿”，从而增强了其燥湿之功。

方中苦参主要含有氧化苦参碱，具有抗炎、抗病毒、抗病原微生物等多种药理作用[7-8]；黄柏主要含有小檗碱，具有抗细菌、真菌、病毒及其他病原微生物的作用[9-10]；蛇蜕具有抗炎、抗菌等药理作用[11-12]；徐长卿具有抗过敏等药理作用[13-14]；槐花主要含有黄酮类成分，具有抗炎、抗病毒等作用[15-16]；刺蒺藜主要含有蒺藜皂苷，临床上常用于治疗风疹瘙痒[17-18]；赤芍主要含有赤芍苷和黄酮类成分，具有抗炎、抗氧化等作用[19]；大黄主要含有蒽醌类、鞣质类成分，具有抗氧化、改善微循环等作用[20-21]；黄芪主要含有黄芪皂苷和多糖，具有增强机体免疫功能、抗应激和较广泛的抗菌作用[22-23]；花椒挥发油具有镇痛、麻醉、抗氧化、驱虫等作用[24-25]。综上，本处方涉及的中药，从现代药理药化的研究结果显示具有治疗湿疹的作用。

4.2复方参柏煎剂作用机制分析 现代医学普遍认为慢性湿疹的发病与Th1/Th2细胞的失衡有关，Th1细胞主要分泌IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IL-22等细胞因子，介导体液免疫，急性期以Th2细胞为主，慢性期以Th1细胞为主[26-27]。IL-4主要由Th2细胞产生，可促进IgG向IgE的类型转换，以自分泌方式促进Th2细胞分化，但抑制Th1细胞增殖及其应答；IFN-γ，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，可促进Th0细胞分化为Th1细胞，并抑制Th2细胞增殖；IL-17主要由外周血T细胞产生，诱导人表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌IL-6、IL-8等细胞因子。

本实验中，复方参柏煎剂可明显降低模型小鼠耳朵的肿胀度，模型小鼠血清中IL-4含量升高，IFN-γ含量降低，Th1/Th2的比值降低，给药组小鼠血清IL-4含量降低，IFN-γ含量升高，使Th1/Th2的比值增大，可见复方参柏煎剂是通过调整Th1/Th2的比例失衡，也就是通过免疫调节来治疗慢性湿疹的。