厚垣孢普可尼亚菌PC7菌株液态发酵条件的筛选1)

梁英辉 穆丹 宋瑞清

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(佳木斯大学)(东北林业大学)

当前，保护生态环境已成为公众共识，农林业的农药使用追求低毒、低残留。无害化、无农药残留一直是生化领域专家的终极目标，因此生物农药成为当前的研究重点[1-2]。厚垣孢普可尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)作为主要的线虫生防菌之一，具有较大的生防潜力和广阔的开发前景[3]。该菌最显著的特征是能产生厚垣孢子，厚垣孢子耐受能力很强，易在土壤中存活，虽会侵染植物根部表皮，但对其无致病性[4]。据报道，厚垣孢普可尼亚菌可以在白花三叶草(Trifoliumrepens)、紫丁香(Syringaoblata)、黑麦草(Loliumperenne)、亚麻(Linumusitatissimum)及其他植物根际中定殖[5-9]，且其在植物病虫害防治工作中发挥重要作用，生防效果获得普遍认同。

目前，厚垣孢普可尼亚菌的生物制剂已被广泛投入生产和生活，例如以厚垣孢普可尼亚菌为原料的线虫必克微粒剂及微胶囊的研制[10]。不同厚垣孢普可尼亚菌菌株生长的营养需求和环境条件存在差异[11]，想要广泛使用厚垣孢普可尼亚菌控制植物寄生线虫，首先必须解决的问题是获得厚垣孢普可尼亚菌高生物量的不同产物。与分生孢子相比，厚垣孢子的产孢难度较高，相关的研究也比较少。国内外学者虽然对该菌的液体、固体培养有一定的研究，但系统化的培养方法还未见报道[12]。由于液体发酵产物(菌丝和厚垣孢子)可以直接用于生物制剂的加工，故从大规模工业生产的角度出发，综合比较认为液体发酵培养是提高厚垣孢普可尼亚菌生物量的最佳方法。

广泛应用厚垣孢普可尼亚菌进行生物防治的首要前提是获得其高生物量产物，摸清其液态发酵条件[13]。生防菌株不同，则生长条件及产孢环境存在差异[14-17]。本研究探究了培养温度、初始pH值、供氧量、接菌量对厚垣孢普可尼亚PC7菌株发酵液生物量的影响，并以此为基础，获得菌株PC7孢子与菌丝体产生的最佳条件，以期为未来大批量工业化培养厚垣孢普可尼亚菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株厚垣孢普可尼亚菌PC7由英国引进，于东北林业大学森林微生物实验室4 ℃保存。

1.2 培养基制备

将200.0 g·L-1去皮马铃薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氢钾、1.5 g·L-1硫酸镁、20.0 g·L-1琼脂，高压121 ℃灭菌20 min，室温贮存[1]，用于制备改良PDA固体培养基。

将200.0 g·L-1去皮马铃薯汁、20.0 g·L-1葡萄糖、3.0 g·L-1磷酸二氢钾、1.5 g·L-1硫酸镁，高压121 ℃灭菌20 min，室温贮存[3]，用于制备改良PD液体培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种培养与孢子收集

将PC7菌种接种于PDA平板中心，24 ℃培养7 d，产孢后取15 mL双蒸水洗脱孢子。采用血球计数器，每个样品重复计数10次，将其制备成1×107个·mL-1的悬浮液，于4 ℃保存[18]。

1.3.2 菌株液态发酵条件的筛选

每个三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培养液，分别接种1 mL孢子悬浮液，不同温度(20、22、24、26、28、30 ℃)条件下，150 r·min-1摇床振荡培养，在3、5、7 d进行镜检、称质量，并确定菌丝干质量，3次重复，以进行最适温度的筛选。

每个三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培养液，调配初始pH值为2、4、6、8、10、12、14。各接种1 mL孢子悬浮液，分别在24、30 ℃下，150 r·min-1摇床振荡培养7 d。镜检、称质量，并确定菌丝干质量，重复3次，以进行最适初始pH值的筛选。

每个三角瓶(500 mL)中加入PD培养液(100、150、200、250、500 mL)，各接种1 mL孢子悬浮液，分别在24、30 ℃下，150 r·min-1摇床振荡培养，在3、5、7 d进行镜检、称质量，并确定菌丝干重，重复3次，以进行最适供氧条件的筛选。

每个三角瓶(500 mL)中加入200 mL PD培养液，分别接入0.05、0.50、1.00、1.50 mL孢子悬浮液，分别在24 ℃、30 ℃下，150 r·min-1摇床振荡培养，3、5、7 d进行镜检、称质量，并确定菌丝干质量，重复3次，以进行最适初始接菌量的筛选。

1.4 数据处理

采用软件Excel 2020和SPSS 25.0进行数据统计和分析，运用新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 最适温度的筛选

不同温度(20、22、24、26、28、30 ℃)条件下，菌株PC7的孢子数量和菌丝干质量见表1。随着温度的升高，PC7产孢数量随之增加，26 ℃培养5 d时孢子的最高数量为20.44×105菌落·mL-1。26 ℃培养至7 d，产孢量为15.22×105菌落·mL-1。28、30 ℃条件下，产孢数量降低，最低时仅3.55×105菌落·mL-1。可见，26 ℃是利用液体发酵获得PC7孢子的最佳温度。由表1可知，在温度为24 ℃情况下培养7 d时，菌丝最大干质量为1.706 3 g。因此，如以产孢数量为生产目标，最适条件为26 ℃培养5 d；以菌丝生产为目标，则最适条件为24 ℃培养7 d。

表1 温度对产孢量和菌丝产量的影响

2.2 最适初始pH值的筛选

在不同的初始pH条件下，PC7菌株的孢子数量和菌丝干质量见表2。由表2可知，当培养温度分别为24、26 ℃时，酸性(pH<7)和碱性条件(pH>9)都不利于PC7菌株产生孢子。初始pH值为2时不产生孢子，随着初始pH值的增加，孢子数量开始上升，在初始pH值升至8时达到最大值，24、26 ℃时孢子数量分别为117.0×105、188.0×105菌落·mL-1。因此，24、26 ℃温度条件下，利用液体发酵获得PC7孢子，最佳的初始pH值均为8，但26 ℃时产孢量远大于24 ℃的产孢量。该试验的最适温度与26 ℃温度条件是利用液体发酵获得PC7孢子的最佳温度结果一致。由此可知，温度26 ℃、初始pH值为8时，可以提高孢子产量，是最适培养条件。

表2 初始pH值对产孢量和菌丝产量的影响

培养温度分别为24、26 ℃时，菌丝的生物量较为一致。菌丝干质量在初始pH值为8时达到最大，分别为1.575 8、1.852 8 g。因此，以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，菌丝生物量受初始pH值影响，最适初始pH值为8。

2.3 最适供氧条件的筛选

在不同的氧气条件(装瓶量)，PC7菌株分别在24、26 ℃培养3、5、7 d，其产孢量和菌丝干质量见表3。由表3可知，在24 ℃下500 mL三角瓶装瓶量150 mL，培养至5 d时，产孢量最大，为104.0×105菌落·mL-1。在26 ℃下500 mL三角瓶装瓶量200 mL，培养至3 d时，产孢量为135.0×105菌落·mL-1；相同条件下培养5 d，达最大产孢量，为232.0×105菌落·mL-1。可见，26 ℃时的孢子产量比24 ℃时的孢子产量大得多。结果表明，PC7菌株培养液在培养温度为26 ℃、500 mL三角瓶装瓶量200 mL条件下，培养5 d时，孢子产量达最大值，为最适氧气条件。

表3 供氧条件对产孢量和菌丝产量的影响

培养温度分别为24、26 ℃时，菌丝的生物量较为一致，装瓶量增多后，菌丝干质量持续加大。24、26 ℃下，500 mL三角瓶装瓶量150 mL，菌丝干质量在培养7 d时达到最大，分别为1.946 2、1.601 2 g。研究还发现，装瓶量为200、250 mL培养3、5、7 d时，培养温度为26 ℃时的菌丝干质量低于培养温度为24 ℃时。由此可知，较低的培养温度促进菌丝生物量的累积。该试验的最适温度与24 ℃温度条件是利用液体发酵获得PC7菌丝的最佳温度结果一致。以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，初始装瓶量影响菌丝生物量，初始装瓶量增多则产量增高。

2.4 最适接菌量的筛选

不同接菌量条件时，分别在24、26 ℃培养3、5、7 d，PC7菌株的产孢量和菌丝干质量见表4。当培养温度为24 ℃、初始接菌量0.5 mL，培养5 d，产孢量最大，为12.50×105菌落·mL-1。当培养温度为26 ℃、初始接菌量0.5 mL，培养7 d，产孢量最大，为40.75×105菌落·mL-1；初始接菌量1.0 mL，相同温度下培养至7 d，产孢量为26.25×105菌落·mL-1。可以看出，初始接菌量为0.5 mL时，有利于提高孢子产量，是最适培养条件。

表4 初始接菌量对产孢量和菌丝产量的影响

在培养温度为24、26 ℃，接菌量1.0 mL时，菌丝干质量在培养5 d时达到最大，分别为1.897 5、1.686 3 g。研究还发现，接菌量为0.05、0.50、1.00、1.50 mL时，培养3、5、7 d，培养温度24 ℃时的菌丝干质量高于培养温度为26 ℃时。因此，以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，菌丝生物量受培养温度影响，24 ℃为最适温度。该试验的最适温度与24 ℃温度条件是利用液体发酵获得PC7菌丝的最佳温度结果一致。

3 结论与讨论

厚垣孢普可尼亚菌在土壤生物防治剂中较为常见，大部分以活性孢子制剂形式投入生产。因此，实现厚垣孢普可尼亚菌孢子的大量生产对防治植物病害具有重要意义。为达到厚垣孢普可尼亚菌孢子发酵的高产量、低成本、工业化、大规模等生产目的，试验通过在不同温度、初始pH值、供氧量、接种量等条件对真菌孢子进行液体发酵，筛选真菌产孢量与菌丝生物量的最适培养条件。研究表明，随着温度的升高，PC7产孢数量随之增加，PC7孢子可以在20～30 ℃生长，26 ℃是利用液体发酵获得PC7孢子的最佳温度。在以往的报道中，过于酸性或碱性环境会抑制厚垣孢普可尼亚菌的孢子产量[12]。本试验中，PC7菌株在pH<6时产孢量较少，当pH=6时产孢量上升，pH=8时的产孢量达到最大值，之后随pH值升高孢子的产量开始下降。这与厚垣孢普可尼亚PC152菌株[13]在pH值为5、长枝木霉T05菌株[18]在pH值为12时产孢量最大的结果不同，可能是由于不同菌株形成孢子的特定条件存在差异。

供氧条件是影响PC7菌株液体发酵产孢的因素之一，装瓶量不同，供氧状态产生差异。PC7菌株培养液在培养温度为26 ℃、500 mL三角瓶装瓶量200 mL，培养5 d时，孢子产量达最大值，为最适供氧条件。统一规格的三角瓶内，装瓶量不同，液体发酵过程中的通气量与溶氧量产生变化，仅在最适供氧条件下，可达最大产孢量。不同接菌量条件的PC7菌株的产孢量存在差异。接菌量为0.5 mL，26 ℃下培养7 d，PC7菌株产孢量最大。较高的温度有利于PC7菌株到达产孢量峰值。温度升高，PC7菌株的孢子产生速率加快，氧气消耗量增大。同一培养温度时，装瓶量和接菌量过大，产孢量下降，会提升生产成本，造成浪费。故为达到理想的产孢量，需综合分析温度、装瓶量、接菌量等因素对于孢子产量的影响。

以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，温度、初始pH值、初始装瓶量、接菌量影响菌丝生物量。较低的培养温度利于菌丝生物量的累积。温度24 ℃、初始pH值为8时，有利于提高菌丝产量，是最适培养条件。初始装瓶量和接菌量的最适条件为500 mL三角瓶装瓶量150 mL、初始接菌量1.0 mL，培养5 d时，菌丝干质量达到最大。接菌量继续加大，菌丝干质量逐渐降低。因此，以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，菌丝干质量受到培养条件的综合影响。

厚垣孢普可尼亚菌的液态发酵需综合多个影响因素，除培养温度、初始pH值、供氧条件、接菌量之外，还受光照、含水量、营养条件、碳氮比、碳氮源、透气性、水活度等因素的影响[19-21]。虽仅为实验室的小规模试验，但本研究对于指导厚垣孢普可尼亚菌剂的大规模生产应用具有一定的意义，为大规模的厚垣孢普可尼亚菌制剂的液体发酵生产、应用提供了1个新的方法及途径。

本研究在不同温度、初始pH值、供氧量、接种量等条件下对PC7进行液体发酵，筛选并获得其产孢量与菌丝生物量的最佳液态发酵条件。结果表明，PC7菌株培养液在培养温度为26 ℃、初始pH值为8、500 mL三角瓶装瓶量200 mL时，以0.5 mL为初始接菌量，产孢量在培养5～7 d时达到最大，是最适产孢条件。以菌丝生产为目标，进行液体发酵生产时，温度24 ℃、初始pH值为8、500 mL三角瓶装瓶量150 mL，初始接菌量1.0 mL时，培养5 d，菌丝干质量达到最大，有利于提高菌丝产量，是最适培养条件。