红缘拟层孔菌菌丝的生物学特性研究*

吴龙月，马水丽，何小芳，苏琮葆，叶丽云，汤坤鹏，吴小平**

（1.福建农林大学生命科学学院菌物研究中心，福建 福州 350002；2.福建省食用菌技术推广总站，福建 福州 350003）

红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）隶属于多孔菌目 （Polyporales）拟层孔菌科 （Fomitopsidaceae）拟层孔菌属（Fomitopsis），是一种木腐菌。菌盖半圆形或马蹄状，菌盖在生长中颜色由白色变为红褐色至黑褐色，边缘从乳白色变为浅黄色或红褐色[1]。红缘拟层孔菌是一种药用价值较高的大型真菌，其味微苦、性平，具有补肺益肾、安神定志、扶正培本、滋补强壮和祛风除湿等作用；对肾炎、支气管炎、癌症、心脏病、糖尿病等有特效，民间常用于治疗“寒腿”病[2-3]。

目前，国内关于红缘拟层孔菌的研究较少，关于其生物学特性方面的研究更是未见报道，故拟对红缘拟层孔菌菌丝体的固体培养条件展开初步研究，以期为红缘拟层孔菌的固体培养和人工驯化提供借鉴的依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

红缘拟层孔菌菌种，由福建农林大学生命科学学院菌物研究中心菌种保藏中心提供。

1.2 试剂与仪器

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麦芽糖、糊精、蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸铵、干酪素和磷酸氢二铵均为国产分析纯。

SPX-250B-Z恒温培养箱，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然。

碳源试验培养基、氮源试验培养基、pH试验培养基、温度试验培养基和正交试验培养基，则均参照参考文献[4]和参考文献[5]的方法配制。

1.4 红缘拟层孔菌的生物学特性研究

1.4.l 碳源试验

参照张峰等[3]的研究方法，以PDA培养基为基础，分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、甘露醇、麦芽糖和糊精作为碳源进行试验。将活化的红缘拟层孔菌菌种分别接种于各种碳源培养基中，以不添加碳源的培养基作为对照，置25℃恒温培养箱中培养，每处理5个重复。接种后，每间隔24 h观察一次菌落特征和菌丝长势，其中菌丝长势根据菌落特征和菌丝生长速率综合判断；采用“十”字交叉法精确测量菌落直径，计算菌丝日生长速度并进行方差分析，每处理重复 5 次[6-9]。

1.4.2 氮源试验

以上述的PDA培养基为基础，分别选用蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、硝酸铵、干酪素和磷酸氢二铵作为氮源进行试验。将活化的红缘拟层孔菌菌株接种于各种氮源培养基中，以不添加氮源的培养基作为对照，置25℃恒温培养箱中培养，每处理5个重复。记录方法同1.4.1。

1.4.3 pH试验

配制pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH试验培养基（培养基灭菌后用灭过菌的1 mol·L-1NaOH和l mol·L-1HCl调节pH）。将活化的红缘拟层孔菌菌株接种于这5种不同pH的培养基中，置25℃恒温培养箱中培养，每处理5个重复。记录方法同1.4.1。

计算机主要由硬件和软件两大部分组成。计算机的硬件设备构成了计算机的外壳(包括输入输出设备、存储设备、运算设备和控制设备)，软件(包括系统软件、通用软件和应用软件)则是支持计算机运行的内部构件，计算机语言编程的正是这些软件。计算机的具体组成可以参照图1。

1.4.4 温度试验

将活化的红缘拟层孔菌菌株接种于温度试验培养基中，将接种后的平板分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的恒温培养箱中培养，每处理5个重复。记录方法同1.4.1。

1.4.5 正交试验

依据碳源、氮源、pH和温度的单因素试验结果，选择这4个因素中最优的3个水平进行4因素3水平的正交试验，设计方案见表1。

表1 影响红缘拟层孔菌菌丝生长的因素水平设计Tab.1 Design of factors and levels affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

如表1所示进行试验，记录方法同1.4.1。

1.5 数据统计与分析

试验数据以平均值表示，采用SPSS 20.0软件对试验数据进行分析，以P<0.05和P<0.01分别表示不同处理间的显著差异和极显著差异。

2 结果与分析

2.1 红缘拟层孔菌的生物学特性

2.1.1 碳源试验

不同碳源对菌丝生长的影响试验结果见表2。

表2 不同碳源对菌丝生长的影响Tab.2 Effects of different carbon sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.2 氮源试验

氮源主要用于机体内含氮化合物的合成，不同氮源对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响试验结果见表3。

表3 不同氮源对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响Tab.3 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表3可知，红缘拟层孔菌在不含氮源的培养基上无法生长，不同氮源培养基对红缘拟层孔菌菌丝体生长的影响不同。其中在以酵母粉作为氮源时，红缘拟层孔菌菌丝较密，生长速度最快，长势最好；在以磷酸氢二铵为氮源的培养基上菌丝生长速率快但菌丝稀疏；另外在以蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸铵为氮源的培养基上，菌丝长势一般；而在以干酪素为氮源的培养基中，菌丝较稀疏且生长缓慢。因此，最终选择以酵母粉、牛肉膏和磷酸氢二铵为氮源进行正交试验。

2.1.3 pH试验

不同pH对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响试验结果见表4。

表4 不同pH对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响Tab.4 Effects of different pH on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

由表4可知，红缘拟层孔菌菌丝体生长速率受培养基pH的变化影响较大。pH为5.0和6.0时，红缘拟层孔菌菌丝长势强，菌丝浓密，且pH为5.0时菌丝生长速率最快，达到6.36 mm·d-1；当pH为4.0和7.0时，菌丝较密但菌丝长势一般；随着pH继续升高，当pH为8.0时，红缘拟层孔菌菌丝生长速率最小（2.62 mm·d-1），菌丝长势最弱。可见红缘拟层孔菌菌丝生长偏好于酸性环境，因此选择以pH为4.0，5.0和6.0进行下一步试验。

2.1.4 温度试验

不同温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响试验结果见表5。

由表5可知，在20℃～40℃的温度范围内，随着培养温度升高，红缘拟层孔菌菌丝生长速度呈先增加后降低的趋势。15℃时菌丝虽密却长势弱，生长速度仅为 0.70 mm·d-1；在 20℃、25℃、30℃、35℃培养时，菌丝越来越密，菌丝生长速率也一直在上升；在35℃培养时，菌丝生长速率达到峰值（7.32 mm·d-1），菌丝密，长势强；而在40℃的培养条件下，菌丝生长速率受高温影响而完全无法生长。可见培养温度对会红缘拟层孔菌的菌丝生长有很大影响，因此选择以培养温度为25℃、30℃和35℃进行正交试验。

表5 不同温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响Tab.5 Elfects of different temperatures on mycelial growth of Fomitopsis pinicola

2.1.5 红缘拟层孔菌培养条件优化的正交试验

基于上述单因素试验结果，从4个因素中各选取较好的3个水平进行正交试验，通过正交设计助手Ⅱv3.1设计试验方案进行试验。试验结果见表6。

如表6所示，极差（r）最大的是温度，为2.5；极差从大到小依次表现为温度、氮源、pH、碳源，说明4因素对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响大小依次为温度＞氮源＞pH＞碳源。根据正交试验结果分析，最优组合A3B2C2D1为红缘拟层孔菌菌丝生长的最适培养条件组合，为以麦芽糖为碳源，酵母粉为氮源，培养基pH为4，培养温度为30℃。在最适的培养条件下，红缘拟层孔菌菌丝的生长速度最快，为13.10 mm·d-1。

表6 红缘拟层孔菌菌丝生长影响因素的正交试验结果Tab.6 Orthogonal experimental results of factors affecting mycelial growth of Fomitopsis pinicola

对正交试验结果进行方差分析，结果见表7。

如表7所示，4个因素对红缘拟层孔菌菌丝生长速率均有显著影响，其差异显著性最大的是温度，其次是氮源、pH、碳源，方差分析的结果与直观分析结果一致。

表7 正交试验结果的方差分析Tab.7 Orthogonal experimental results of F-test

3 讨论

红缘拟层孔菌的单因素试验表明，在碳源为单糖或双糖时更适合菌丝体生长，这一特性与黄毛黄侧耳的生物学特性相一致[10]。在氮源为干酪素和磷酸氢二铵时，则几乎不能为红缘拟层孔菌所利用，而在氮源为蛋白胨、尿素、牛肉膏和硝酸铵时，菌丝长势较好，这可能是因为有机氮源中含有可以促进菌丝生长的成分，如微量元素、核苷酸、维生素等一些非氮成分[4，11]。红缘拟层孔菌的菌丝生长速率在pH为5.0时生长最快，说明红缘拟层孔菌偏好在弱酸性环境中生长，这与迷宫栓孔菌ZT-055菌丝体的生物学特性的研究一致[3]。培养温度试验表明，35℃时红缘拟层孔菌长势最好，生长最快，正交试验结果也表明，温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响最大，这与郝金斌等[12]的研究一致，属中高温性菌。通过试验得到红缘拟层孔菌菌丝生长的最适培养条件为：以麦芽糖为碳源、酵母粉为氮源，培养基pH为4，培养温度为30℃。因培养基灭菌前后pH变化较大，故本次试验在培养基灭菌后再通过加盐酸或氢氧化钠来调整pH。红缘拟层孔菌的生长速率不高，而本研究中对红缘拟层孔菌的固体培养与菌种保藏具有指导意义，为红缘拟层孔菌的人工培养提供了理论依据。