镁合金材料慢性毒性与致癌合并试验中分时段采血的必要性研究

刘香东，赵增琳，王鸾鸾，展荣凯，刘增祥，吴新宇，刘成虎

(山东省医疗器械和药品包装检验研究院，山东济南 250101)

慢性毒性与致癌合并试验是将受试物长期反复给予试验动物，观察其对试验动物的慢性毒性和致肿瘤作用，确定慢性毒性的最大无作用剂量和致癌的可能性。该试验也是费时最长、参加人员最多、消耗财力和物质最大、操作繁琐复杂而又经不起重复的高难度研究工作[1]。

我国2007年就发布了化妆品慢性毒性与致癌合并试验的要求原则[2]。国家参照经济合作与发展组织化学品测试指南No.453-1981(致癌性研究)和No.451-2009(慢性毒性/致癌性结合研究)，编制出版了化学品、食品、农药等慢性毒性和致癌合并试验国家标准[3-5]。国内也陆续发表了一些慢性毒性与致癌性试验的研究，通过慢性毒性与致癌合并试验了解了部分药物的慢性毒性和致肿瘤作用[6]。目前，医疗器械领域还没有建立慢性毒性与致癌合并试验国家标准，这使得医疗器械生产企业在需要做慢性毒性与致癌合并试验时无标准可循。因此，建立医疗器械领域慢性毒性与致癌合并试验国家标准刻不容缓。

已经发布的各行业慢性毒性与致癌合并试验标准要求在试验第3、6、12和第18个月对动物进行临床病理检测，且建议每个时段取血为同一只大鼠。但是，初步研究发现分时段取血易导致动物出现一定的死亡率，大大降低动物存活率，并且取血量无法满足临床病理检测要求。

镁合金材料密度小、比强度高，具有优异的力学性能、良好生物相容性和可降解性，近年来成为可降解生物医用材料的研究热点[7-8]。目前镁合金材料作为医用材料大多还处于研究阶段，其转化为临床产品仍需要大量的体内外安全评价数据[9]。镁合金材料制成的接骨板需要长期植入人体，这就需要考虑其对人体的慢性毒性作用和致肿瘤作用，即慢性毒性与致癌合并试验。

因此本文将镁合金材料——接骨板植入到大鼠皮下，进行长达18个月的慢性毒性研究，以期为镁合金材料在临床应用以及慢性毒性与致癌合并试验是否需要分时段取血提供参考。同时为建立医疗器械领域慢性毒性与致癌合并试验国家标准提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备本研究使用的主要仪器包括：日立全自动生化分析仪(7180型，日立株式会社日立高新技术)；全自动血液分析仪(XN-1000)和全自动凝血分析仪(CA-7000)均购自希森美康株式会社)；高速冷冻离心机(Multifuge X3，赛默飞世尔科技有限公司)。

1.1.2 试验动物与动物管理SD(Sprague-Dawley)大鼠160只，SPF级，雌雄各半，6～9周龄，体质量160～180 g，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006，已通过山东省医疗器械和药品包装检验研究院实验动物伦理委员会伦理审查(R20190411)。

1.1.3 试验样品可降解镁合金颅颌面内固定系统(接骨板)，型号/规格为Ø16×21 mm，批号19032601，材料为Jokia BM ZG20。

1.1.4 试剂血清生化检测试剂盒(日本和光纯药工业株式会社)；血清生化多项质控品(美国贝克曼库尔特有限公司，规格5 mL)；凝血测定试剂盒及凝血质控品(Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH，凝血质控品，规格1 mL)；血常规指标检测试剂[希森美康生物科技(无锡)有限公司]；血常规指标检测试剂质控品(SYSMEX，规格3.0 mL)；戊巴比妥钠(Ruitaibio，规格25 g)。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组选取SD大鼠240只，按体质量随机分为试验组和对照组。试验组和对照组均设置4组，即分别为植入3、6、12和18个月。各组每种性别各15只大鼠。每种性别动物的体质量差异不超过平均体质量的20%。

1.2.2 植入剂量设计镁合金材料人体拟用临床最高剂量为4.5 g，假设人平均体质量60 kg，按50倍量进行大鼠实验，即植入剂量为3.75 g/kg。一只大鼠实际植入量为0.75 g(大鼠体质量按0.2 kg计)。根据镁合金密度，本次试验选取半径0.8 cm，厚度0.21 cm的圆片作为植入物，每只大鼠植入1个圆片。

1.2.3 皮下植入按照40 mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉动物，用电推剪将动物背部手术区的被毛除掉，将制备好的镁合金材料植入试验组大鼠背部皮下组织中。对照组动物做假手术处理。

1.2.4 临床病理学检查植入第3、6、12和第18个月。试验组和对照组，每组检查雌雄各10只动物。检测指标及对应英文缩写见表1。

表1 临床病理检测指标及对应英文缩写

1.2.5 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析，试验结果以±s表示，对动物各时段血液学指标、血生化指标进行独立样本t检验，如果P＜0.05则认为两组之间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镁合金材料对大鼠血液学指标的影响

在植入后第6个月时，试验组雌性大鼠RBC显著性低于对照组雌性大鼠(P＜0.05)，试验组雄性大鼠PT显著性高于对照组雄性大鼠(P＜0.01)；在第18个月时，试验组雄性大鼠MONO显著高于对照组雄性大鼠(P＜0.05)。在4个时间段内，其它血液学指标两个组间差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表2。

2.2 镁合金材料对大鼠血生化指标的影响

在第6个月时，试验组雌性大鼠TBIL低于对照组雌性大鼠(P＜0.05)，试验组雄性大鼠Ca2+浓度高于对照组雄性大鼠(P＜0.05)。在第18个月时，试验组雌性大鼠TG高于对照组雌性大鼠(P＜0.05)。在4个时间段内，大鼠其它血生化指标两个组间差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表3。

3 讨论

不同时间段取血检测比较，发现4个时间段内的试验组和对照组相比，血液学指标中RBC、PT、MONO有显著差异，血生化指标TBIL、Ca2+、TG存在显著差异。RBC病理性降低可见于各种贫血等，PT延长可见于纤维蛋白原缺乏等，MONO病理性升高可见于某些感染等。TBIL降低无明显的临床义，TG和Ca2+病理性升高可见于肾脏损伤等。虽然血液学、血生化检查中个别指标有些差别，但波动均在本实验正常参考范围，临床观察显示试验动物无相关疾病或损伤表现，差异仅出现在单个性别组，未体现毒性特征，所以差异非病理性变化，仅体现统计学意义。

试验观察发现，SD大鼠在第12个月后，对照组和试验组动物均出现大量自发性肿瘤。因此，第18个月的临床数据，由于大鼠不同程度的自发肿瘤发生，导致临床病理指标标准差偏大，但未发现显著性差异。

在一定的时间内，采血量和采血次数的增加，会引起大鼠一定的应激性反应或采血部位的伤害[10]。多次采血方式一般选取眼眶后静脉采血，颈静脉采血，心脏穿刺采血等，这些采血方式成功率未达到100%。状况良好的大鼠一般采血量建议不超过循环血量的10%，即大鼠每次最大采血量为1.6 mL[11]。取血量较少，无法同时满足临床病理检测。且后期由于大鼠自发肿瘤发生，对大鼠的生活造成一定的影响，此时再进行取血，极易造成动物死亡，无法判断大鼠提前死亡原因，对判断肿瘤发生时间产生干扰。

多次采血可能会与药物的毒性作用产生一定的叠加效应，因此设置卫星组动物采血比较合适[12]。通过文献搜索，大部分选择与本文同样的条件，即增加卫星组来满足慢性毒性与致癌合并试验中的各时段采血要求[13-14]。也有部分只是在文中笼统说按照标准分时段取血，未明确是否为同一只大鼠[15]。即使明确同一只大鼠，在文中的相关数据很少[16]。也有相关文献在报道慢性毒性与致癌合并试验结果时直接明确未分时段取血[17]。

本次实验结果提示，为保证动物的存活率，在建立医疗器械慢性毒性与致癌合并试验国家标准中或者在进行医疗器械/生物材料慢性毒性与致癌合并试验时，对镁合金材料(接骨板)取消分时段取血是可行的。同时我们建议增加临床观察频率，使濒死动物能及时取血、解剖，以便确定死亡原因，从而更好的分析医疗器械材料对大鼠的慢性毒性作用以及致癌作用。