人乳头瘤病毒相关的口咽鳞状细胞癌分子病理诊断新进展

杨 欣，郭会芹

(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院病理科，北京 100021)

口咽癌(oropharyngeal cancer，OPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，主要来源于舌根、扁桃体、软腭和咽后壁等部位，病理类型多为鳞状细胞癌，男性多发。2015年中国癌症统计显示唇癌、口腔癌及口咽癌、喉咽癌的总发病率为48.1/10万，死亡率为22.1/10万[1]。中国OPC在2008—2012年间每年发病率约为3.28/10万(男性4.26/10万，女性2.26/10万)，占所有癌症新发病例的1.16%，位列第20位[2]。世界范围内18%～72%口咽鳞状细胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC)的发生与高危HPV感染有关[3]，其中HPV16、18为两种主要致癌病毒[4]。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)提出HPV相关OPSCC的发生率与地域有关，南欧发生率小于20%，北美发生率大于60%[5]，而亚洲发生率为17%[6]。中国不同地区HPV相关OPSCC的发生比例各异，数据显示中国华南、华东和东北地区的阳性率分别为20.8%、11.7%和5.51%[7-9]。WHO头颈部肿瘤分类2017版基于HPV感染状态，将OPSCC分为HPV阳性及HPV阴性两个组织学类型[10]，HPV阳性的OPSCC有其独特的生物学行为和较好的临床预后。HPV状态判断的方法有常规HE染色下形态学评估、p16免疫组织化学染色和HPV病毒特异性检测。

1 HPV相关口咽癌的病理形态学特征

WHO头颈部肿瘤分类2017版指出：HPV阳性的OPSCC多数呈非角化形态，肿瘤起源于腺窝上皮，形成大而坚实且边缘光滑的巢状或者小叶状细胞团，中央可伴有坏死；肿瘤细胞胞质少，细胞边界不清，细胞核深染，呈椭圆形至梭形，核质比大，有丝分裂活性及凋亡活性较高，往往呈基底样形态，伴有丰富的淋巴细胞浸润[10]。HPV阴性的OPSCC多数呈角化形态，因具有丰富且成熟的细胞质，独特的细胞边界和细胞间桥的多边形细胞组成，其生长模式通常是浸润性的，呈角状的肿瘤巢具有锥形延伸和明显的间质结缔组织增生，所以HPV阴性的OPSCC比HPV阳性的OPSCC更容易发生淋巴结转移[11]。但是，形态学判断并不完全准确，例如认为所有伴角化的鳞状细胞癌均与HPV无关是不正确的，因为一小部分HPV阳性的OPSCC也可表现出与常规鳞状细胞癌相同的角化，尤其既往接受过治疗的病例，角化可能更明显[12]。尽管经典型HPV阳性的OPSCC呈低分化形态，缺乏角化或者往往角化不显著，伴大量有丝分裂，但是患者预后良好，其分子机制需进一步研究。HPV阳性OPSCC表达常规鳞状上皮标记物，如p40、p63和CK5/6，p53往往呈野生型，未出现突变。

2 p16免疫组织化学染色

p16蛋白是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，在持续性HPV感染中由于E7蛋白降解视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)而出现过表达，p16免疫组织化学染色(immuno-histochemistry，IHC)被证明是OPSCC一种敏感的HPV感染状态的替代检测方法。美国病理学家协会(College of American Pathologists，CAP)发布了头颈癌HPV病毒检测指南，建议使用p16 IHC作为肿瘤HPV感染状态检测的替代方法[13]。该方法可应用于组织标本或细胞蜡块，操作简单且费用低，是临床上应用最广的检测方法。p16 IHC显示细胞质和细胞核弥漫性表达，当70%以上的肿瘤细胞呈现中等到强的弥漫的细胞质和细胞核着色时，HPV结果判读为阳性。研究[14]提示，50%～70%肿瘤细胞着色的病例需要增加HPV病毒检测进一步确定是否存在HPV感染。当用淋巴结细针穿刺标本的细胞块进行p16免疫组化时，CAP建议判读标准中着色肿瘤细胞的数量可以减少10%～15%，因为淋巴结转移往往因发生囊性变而导致肿瘤细胞出现明显的退变和坏死[13]。

理论上，p16过表达由病毒E7蛋白降解Rb蛋白所致，与感染病毒的亚型无关，也就是说各种亚型的病毒感染均能反映在p16蛋白上，因此其敏感性较高，接近100%，但其特异性存在质疑[15-17]。研究显示，p16弥漫强阳性还可见于包括皮肤鳞状细胞癌、腺样囊性癌、神经内分泌癌和黑色素瘤等多种肿瘤，此时p16过表达可能与Rb基因突变所致的功能失调有关，而与HPV感染无关[12]。Nauta等[18]分析了一组口咽癌中p16+/HPV DNA-患者的预后，发现与p16和HPV DNA均阳性患者相比，该亚组5年总生存率明显较差，接近p16-/HPV-组，进一步说明p16 IHC检测存在假阳性判读的情况。因此，临床现行的p16 IHC作为HPV风险分层的独立检测方法存在诊断风险，OPSCC的精准诊疗中需要更可靠且可行的HPV病毒特异性检测。

3 HPV病毒特异性检测方法

3.1 原位杂交检测HPV DNA

原位杂交的方法是基于基因层面，利用其复制、转录的特点，将带有特定标记的已知序列核酸探针与待测细胞或者组织中提取的核酸进行杂交，从而定位有HPV感染的细胞或者组织，并可对其进行定量定性分析。DNA原位杂交(in situhybridization，ISH)是临床上较为常见的分子检测技术，在OPSCC的HPV检测当中也是经常被纳入二线参考的方法。临床上DNA ISH检测既可以使用组织标本，也可以使用细胞标本，可以检测多种HPV亚型。其最大的优点是使肿瘤细胞内的靶DNA可以在细胞及组织切片上呈可视化，从而确保基因检测的准确性[19]。目前，关于DNA ISH检测方法的敏感性及特异性的数据较少，Qureishi等[20]的研究显示，DNA ISH与p16 IHC相比，具有较高的特异性(88%和82%)及较低的敏感性(88%和94%)，尤其是当肿瘤组织中的HPV DNA拷贝数较低时检测敏感性会进一步降低。

3.2 PCR检测HPV DNA

PCR是体外酶促合成特异性DNA片段的一种方法，通过特定引物介导目标DNA(E6/E7)的扩增，以此检测HPV感染状态。有实验将107例HPV阳性标本提取的DNA分别用GP、SP16/SP18、SP16b 3组引物进行扩增，结果证明以GP作为共同引物检出率较高[21]。新鲜冷冻样本及福尔马林固定石蜡包埋样本(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)均可进行HPV DNA PCR检测[22]，PCR克隆DNA具有操作简便、省时的优点。文献报道，以p16 IHC为对照，DNA PCR检测HPV感染状态的敏感性及特异性分别为97%和87%[20]。DNA PCR与DNA ISH相比较，两者敏感性相似，但是前者的特异性低于后者[23]。有研究发现通过ddPCR(droplet-based digital PCR)检测血液循环肿瘤DNA(ctDNA)中的HPV病毒表达情况，可作为一种有用且无创的检测方法。通过对治疗前的OPSCC血液进行HPV16 ctDNA检测发现，ddPCR评估的HPV16 ctDNA拷贝数与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移，以及临床分期显著相关[24]。

3.3 原位杂交检测HPV RNA

HPV E6/E7 mRNA是CAP推荐的金标准检测方法[25]，E6/E7基因是HPV的主要致病基因，E6基因通过抑制P53基因阻断细胞凋亡，E7基因可抑制RB基因而使细胞周期失调控。相比于HPV DNA检测，E6/E7 mRNA表达水平提示的是有转录活性的病毒的存在，是目前HPV检测的重要手段。研究显示：RNA ISH敏感性为97%，与p16 IHC具有较高的一致性(93%)[26]。一项爱尔兰数据以p16 IHC阳性病人为基数，对HPV DNA ISH/RNA ISH/DNA PCR技术的敏感性及特异性进行对比，结果显示：3种检测方法在p16+病例中有相似的敏感性(RNA ISH为89%；DNA ISH为74%；DNA PCR为79%)，而两种ISH技术的特异性均优于DNA PCR(RNA ISH为100%；DNA ISH为100%；DNA PCR为67%)。该研究认为，3种方法中准确性最高的是HPV RNA ISH(95%)，其次是HPV DNA ISH(90%)，而HPV DNA PCR最低(72%)[23]。随着HPV阳性的OPSCC的研究进展，用于检测HPVE6/E7基因的广谱鸡尾酒探针已经可检测多种HPV亚型的E6/E7基因，从而扩大了HPV的检出率[27]。RNAscope技术是最新的原位杂交技术，其RNA探针敏感性高于PCR-反向斑点杂交，解决了FFPE中mRNA降解的问题[28]。研究显示，以p16 IHC为参考，RNAscope技术检测HPV的敏感性为93.4%[29]。然而，当检测多种高危型HPV(如HPV16、18、52、53等)时，则需要使用多种探针，检测费用较昂贵。

3.4 PCR检测HPV RNA

FFPE肿瘤组织中RNA存在降解，提取的核酸量少、质量低，并且常是片段的或经过化学修饰的RNA，给RNA PCR检测方法带来了挑战。另外，口咽癌的组织学标本大多数为小活检组织，FFPE切片中肿瘤组织量少，这更增加了RNA PCR检测在临床样本中实施的难度。因此，关于HPV RNA PCR检测方法的报道较少，其与HPV DNA PCR一样有着高敏感性、低特异性、并且无法分辨肿瘤细胞中的HPV是否是存在于非肿瘤上皮或间质中的非特异性感染[30]。

Aptima HPV检测是临床上广泛应用于宫颈癌筛查的方法，可同时检出14种高危型HPV的E6/E7 mRNA，是圣地亚哥加州地区Hologic公司推出的商品化的基因检测技术[31]。该检测价格低廉，操作简易，美国食品药品监督管理局(FDA)批准的适用标本是细胞学样本，尚未批准用于FFPE标本，因此目前该方法在OPSCC患者中的应用局限在了颈淋巴结转移灶细针穿刺样本[32]。最近Kir等[33]在宫颈鳞状上皮内病变和宫颈鳞癌中成功进行了FFPE标本Aptima HPV检测的初步尝试，为扩大Aptima HPV检测在OPSCC中的应用赋予了希望。

4 小结和展望

虽然中国HPV相关的OPSCC患者比例低于欧美，但鉴于其独特的临床分期和对治疗的反应，精准且高效鉴别HPV阳性的OPSCC成为分子病理诊断的核心内容。并且，中国学者的研究证明第8版AJCC分期系统对于我国口咽癌患者也适用，中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)也在2019年V1版头颈部肿瘤诊疗指南中正式采用了美国第8版AJCC分期系统[34]。HPV阳性的OPSCC有其形态学特点和p16弥漫强阳性表达的特点，但是目前指南中推荐的单独p16 IHC判断方法，可能会出现少数p16阳性，但并无HPV感染的病例。随着HPV病毒特异性检测技术的进步，尤其是具有转录活性的病毒E6/E7 mRNA检测技术(如RNAscope技术和Aptima HPV技术)的普及，HPV病毒特异性检测有可能会从现在指南中推荐的“额外的检测”转变为p16 IHC的联合检测，从而提高HPV相关OPSCC诊断的准确性，实现OPSCC的精准诊断和精准治疗。