南药牛大力组培苗生产技术规程

黄小华 聂天军 班兆丹 熊发前 韦荣昌

摘要    遵照《中药材生产质量管理规范》（GAP）的宗旨，规范南药牛大力组培苗生产的物种选择、组织培养、瓶内炼苗、瓶外炼苗、出圃、装框、运输和档案记录，旨在提高南药牛大力组培苗的质量。

关键词    牛大力;南药;组培苗;生产技术规程

中图分类号    S533    文献标识码    A    DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.009

Technical Regulations on Propagation of Callerya speciosa via Tissue Culture

HUANG Xiaohua1    NIE Tianjun2    BAN Zhaodan3    XIONG Faqian1    WEI Rongchang1

（1. Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China;2. Guangxi Litop Rice Corporation Co.，Ltd.，Narming，Guangxi 530022，China;3. Guangxi Wanchuan Seed Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530007，China）

Abstract    According to the Good Agricultural Practice of Chinese Crude Drugs （GAP），technical regulations on propagation of Callerya speciosa via tissue culture were prepared. The regulations provide for selection of cultivars，tissue culture，hardening of tissue cultured plants in and out of tubes，transplanting，packaging，transportation and recording to improve the quality of tissue cultured plants of C. speciosa.

Keywords    Callerya speciosa;southern medicine;tissue culture seedling;technical regulations on production

牛大力[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]，俗称美丽崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）、牛大力藤、牛牯大力、山莲藕，是豆科（Leguminosae）鸡血藤属多年生藤本植物。牛大力是我国传统名贵南药[1]，始载于《生草药性备要》[2]。牛大力以干燥的块根入药，性涩（平）、味甜（甘）、气微，归肺、肝经，主要活性成分为牛大力多糖、芒柄花素和高丽槐素，具有舒筋活络，补虚润肺和健脾的功能[3-6]。牛大力药食同源，块根富含淀粉，是桂龙药膏、强力健身胶囊及壮腰健肾丸等多种中成药的主要原料，广大岭南民众也有用牛大力炮制药酒、药膳或煲汤的习惯[7]。

牛大力主要分布于岭南地区，通常生于海拔不高于1 500m的疏林、灌丛和旷野中[8]。生产上牛大力利用种子繁殖种苗，发芽势和发芽率均不高[9]。而通过组织培养技术能够得到优质的健康种苗。为了规范牛大力组培苗的生产，以提升其质量和产量，特此制定本规程。

1    范围

本规程规定了南药牛大力[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]组培苗规范化生产的物种选择、组织培养、瓶内炼苗、瓶外炼苗、出圃、装框、运输和档案记录。

本规程适用于广西境内南药牛大力组培苗的规范化生产。

2    引用标准

GB 3095—2012环境空气质量标准;

GB 5084—2021农田灌溉水质标准;

GB 15618—2018土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）;

NY/T 394—2013绿色食品肥料使用准则;

GB/T 8321.9—2009农药合理使用准则（九）;

NY/T 393—2020绿色食品    农药使用准则;

GB 15569—2009农业植物调运检疫规程。

3    物种选择

豆科鸡血藤属植物美丽鸡血藤[Callerya speciosa （Champion ex Bentham）Schot]。

4    组织培养[10-12]

4.1    外植体的选择与灭菌

应选用品种纯正，生长势旺，熟期一致的丰产单株作母株。母株开花前，套袋，以隔绝外来花粉，避免异交。秋末冬初，当荚果表面由绿色变为棕褐色或褐色时，表明种子已经成熟。采摘饱满未开裂的荚果，剪去果柄，浸泡于0.05%的洗衣粉（m/m）或洗潔精（V/V）水溶液中，用软毛刷轻轻刷洗荚果表面，清除荚果表面的污垢和柔毛，8～12 min后取出荚果，用线状自来水冲洗15～40 min;用消毒滤纸或无菌吸水纸吸干表面水分，转至超净工作台上，用75%的乙醇浸泡30～50 s，无菌水冲洗1～2次;置于灭菌玻璃瓶中（所装材料应少于瓶子容积的1/3），穿戴乳胶防护手套，用1 g/L的HgCl+2～3滴吐温-20浸没材料，消毒15～20 min，取出并用无菌水冲洗20～25 min（宜分4～5次冲洗，每次4～5min）;吸去表面水分，用解剖刀纵向剖开荚果，然后用镶子将种子小心夹出（不得夹伤种子），得到无菌外植体。

4.2    种子萌发获得无菌试管苗

将种子接种到萌发诱导培养基（MS+1.5～3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L KT+0.2～0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IBA+500 mg/L PVP+5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH 5.8～6.0，配制分装后，于121℃灭菌20 min）上，每瓶培养基接种1粒种子，种脐朝下，插入培养基的深度为种子长度的2/3，在培养温度为23～28℃、光照强度为20～40 μmol/（m·s）、时间为10～16 h/d的条件下初代培养20～30 d，诱导种子萌发，获得无菌试管苗。

4.3    试管苗丛生芽增殖与分化

将种子萌发获得的丛生芽切取单个不定芽，转接于增殖与分化培养基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2～0.5 mg/L NAA+5 g/L 琼脂+30g/L蔗糖，pH5.8～6.0，配制分装后，于121℃灭菌20 min）中，在培养温度为23～28℃，光照强度为20～40 μmol/（m·s）、时间为10～16 h/d的条件下继代培养20～25 d，诱导丛生芽增殖与分化。

4.4    试管苗生根培养

当试管苗高达2～4 cm时，切取2～3 cm左右的单个不定芽，转接于生根培养基（1/2MS+1.0～2.5 mg/L IBA+1.5 mg/L NAA+5 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖），pH 5.8～6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20 min）中，在培养温度为23～28℃、光照强度为20-40 μmol/（m·s），光照时间为10～16 h/d的条件下培养，诱导试管苗生根，通常情况下，6～8d即可产生根原基，20～30 d后得到具2～3条不定根的完整植株（瓶苗），当瓶苗高达瓶口时，即可炼苗。

5    瓶内炼苗

得到带根的完整植株后，将瓶苗置于遮光度50%～70%，温度（25±2）℃的室内环境中，将光照强度从20～40μmol/（m·s）逐步提高到75～ 100μmol/（m·s）。14～21d后，先松开瓶盖1～2 d，然后半开瓶盖l～2d，最后完全打开瓶盖，沿瓶壁缓慢添加适量自来水，以恰好浸没培养基为宜，炼苗3～5d，当植株表面形成角质后，用灭菌长镊子轻轻夹出瓶苗，放入清水盆中，小心洗去植株根部残留的培养基，再用500～800倍液的50% 多菌灵可湿性粉剂浸泡20～30min，待移栽至瓶外炼苗。

6    瓶外炼苗

包括砂床炼苗和育苗袋炼苗2个阶段，均要求炼苗环境中的空气应符合GB 3095—2012环境空气质量标准[13]的规定;灌溉水应满足GB 5084—2021农田灌溉水质标准[14]的要求，土壤应按照GB 15618—2018 土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）[15]执行。

6.1    砂床炼苗

把细河砂按20～30目：30～45目：45～60目=2：5：3（V：V）拌匀，作成宽1.2～1.4 m，高15～20 cm的砂床，砂床上再覆一层1～2 cm厚的河砂（30～45目）。用800～1 000倍液的甲基托布津或300～500倍液的95%敌克松喷雾杀菌，1d后，淋透水。幼苗栽于砂床上，株行距（8～10）cm×（10～12）cm。移栽后10 d内，保持砂床内相对湿度为85%～95%，控制白天温度在23～25℃，夜间温度在15～18℃，同时注意避免直射光照射。移栽后15～20 d，即可移至育苗袋炼苗。

6.2    育苗袋炼苗

先将红壤土的表土铲去，选取心土，破碎过筛（10～20目），用0.2%～0.4%的高镒酸钾溶液或多菌灵可湿性粉剂800～1 000倍液均匀喷洒消毒，加入6%～10%的腐熟有机肥，3%～5%的生石灰，搅拌均匀，作成圆锥形土堆，用聚丙烯塑料薄膜覆盖密封，在高温天气条件下闷晒7～10 d，或采用高温干热灭菌法进行基质灭菌。当灭菌后的红壤土温度降至室温，装入（8～10）cm（口径）×（12～14）cm（高度）的无纺布育苗袋中，土高10～12cm为宜。

将经过砂床炼苗的牛大力小苗栽植于育苗袋中，每袋栽1株。然后把育苗袋摆在平整的地块上，宽以1.2～1.4 m为宜，长依地而定，四周开好排水沟。淋足定根水，搭建高的简易拱棚，并覆盖一层白色的聚乙烯薄膜，四周用土块压实，以达到保温和防风避雨的目的[9]。

6.3    田间管理

6.3.1    查苗补苗    移栽后5～7d，揭膜查苗，如有死苗，应连同育苗袋一起清理，并用新的育苗袋补种相同苗龄的小苗。

6.3.2    水分管理    保持土壤相对含水量为田间持水量的40%～60%，空气相对湿度为60%～80%。雨后及时清沟排水，降低土壤和空氣中的湿度;当持续高温干旱时，应早晚喷雾（水）降温，并揭开拱棚两头薄膜，通风换气，必要时还应加盖遮阳网，降低光照强度。

6.3.3    除草追肥    不定时揭膜检查，根据杂草的长势，及时除去育苗袋中、地块及沟边的杂草，同时注意培土固根，以防倒伏。结合除草培土，进行追肥。移栽后7～10 d，淋施腐熟的有机肥水或喷施1/2 MS营养液，连施2次。此后，每14 d追肥1次，将腐熟的有机肥撒施在小苗的四周。肥料的选择和使用应符合NY/T 394—2013绿色食品肥料使用准则[16]的相关规定。

6.4    病虫害防治

牛大力组培苗的病虫害较少，主要有茎腐病和甥虫。应优先采取物理防治和生物防治，在符合GB/T 8321.9—2009农药合理使用准则（九）[17]和NY/T 393—2020绿色食品农药使用准则[18]的前提下，科學选择低毒低残留高效的化学农药，将病虫危害控制在经济允许范围内。

6.4.1    茎腐病    茎腐病为害茎基部，先是叶片萎蔫，然后茎基部和根部逐渐腐烂，幼苗死亡。因此，炼苗时，当幼苗成活后，应缓慢降低育苗基质和空气中的湿度。同时喷施70%百菌清可湿性粉剂，或50%多菌灵可湿性粉剂，或50%敌克松可湿性粉剂600～1 000倍液进行防控。一旦发现中心病株，应马上清理，并在病坑的四周淋（喷）施上述药剂，以防病害通过土壤进行传播[19]。

6.4.2    蚜虫    蚜虫为害叶片，刚孵化出来的幼虫从幼叶开始啃食，然后啃食新叶。大多数被啃食后的叶片只剩下叶脉，甚至整个叶片脱落，严重影响植株的健康生长。可用诱虫黄板诱杀，或以2%啶虫脒可湿性粉剂1 500～2 000倍液，或10%毗虫琳可湿性粉剂2 500～3 000倍液喷洒叶面[20]。

7    出圃

当组培苗长出3～5片真叶，株高15～20 cm时，即可出圃。出圃前，应先割掉突破透育苗袋的根系，正常田间管理5～7 d，然后逐渐降低育苗基质和空气中的湿度。

8    装筐

将种苗连同育苗袋一起，装入洁净的带盖塑料筐（筐高20～25cm）内，单层摆放，育苗袋与育苗袋之间排列紧凑，以确保运输途中不散坨。

9    运输

调运前，应按照GB 15569—2009农业植物调运检疫规程[21]的要求，提出调运检疫申请，并取得植物检疫机构签发的植物检疫证书。同时，应对运输工具进行全面消毒，并注意防晒和防雨。

10    档案记录

对组织培养、瓶内炼苗、瓶外炼苗、出圃、装框、运输和档案等环节采取的措施进行详细记录，建立生产档案。

参考文献

[1]莫火月，郑海，黄意成，等.南药牛大力本草考证及性状鉴别[J].时珍国医国药，2018，29（6）：1 361-1 362.

[2]清·何克谏.生草药性备要[M].广州：广东科技出版社，1717：26+58.

[3]韦荣昌，白隆华.药用植物牛大力的研究概况[J].种子，2015，34（12）：47-50.

[4]广西壮族自治区卫生厅编.广西中药材标准（1990年版）[M].南宁：广西科学技术出版社，1992：31-32.

[5]广西壮族自治区食品药品监督管理局.广西壮族自治区壮药质量标准（第一卷，2008年版）[M].南宁：广西科学技术出版社，2008：61.

[6]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（上册，第二版）[M].北京：人民卫生出版社，1996：205.

[7]韦荣昌，吴庆华，黄浩，等.广西无公害牛大力生产技术规程[J].现代中药研究与实践，2016，30（1）：1-3.

[8]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第四十卷）[M].北京：科学出版社，1994：162.

[9]韦荣昌，潘丽梅，吴庆华，等.牛大力种子苗生产技术规程[J].热带农业科学，2017，37（12）：48-51.

[10]王祝年，李志英，徐立，等.牛大力的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2005，（6）：800.

[11]韦莹，马小军，董青松，等.牛大力离体培养与植株再生条件的优化[J].湖北农业科学，2012，51（23）：5 499-5 502.

[12]广西壮族自治区药用植物园.一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快速繁育种苗的方法：201310010861. 3[P].2013-01-11.

[13]中华人民共和国环境保护部中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.环境空气质量标准：GB 3095-2012[S]. 北京：中国环境科学出版社，2016-01-01.

[14]中华人民共和国生态环境部中华人民共和国国家市场监督管理总局.农田灌溉水质标准：GB 5084-2021[S].北京：中国环境科学出版社，2021-07-01.

[15]中华人民共和国生态环境部中华人民共和国国家市场监督管理总局.土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB 15618-2018[S].北京：中国环境科学出版社，2018-08-01.

[16]中华人民共和国农业部.绿色食品肥料使用准则：NY/T 394-2013[S]，北京：中国农业出版社，2014-04-01.

[17]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.农药合理使用准则（九）：GB/T 8321. 9-2009[S]，北京：中国标准出版社，2009-12-01.

[18]中华人民共和国农业农村部.绿色食品农药使用准则：NY/T 393-2020[S].北京：中国标准出版社，2020-11-01.

[19]韦荣昌，吴庆华，闫志刚，等.牛大力种子规范化生产操作规程[J].热带农业科学，2018，38（3）：42-45.

[20]徐立，李志英.牛大力种苗繁育及高产栽培技术[M].北京：中国农业出版社，2011：21.

[21]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.农业植物调运检疫规程：GB 15569-2009[S]，北京：中国标准出版社，2009.