吡虫啉在生菜中的吸收迁移及转化行为

刘倩宇 李远播 董丰收 刘新刚 徐军 吴小虎 郑永权 刘颖超

摘要 为了探究吡虫啉在植物中的吸收转运规律，本研究选择生菜为研究对象，将其在含有1 mg/kg吡虫啉的水培液中持续暴露120 h，利用超高效液相色谱三重四极杆质谱检测吡虫啉及其5种代谢物在生菜不同部位动态吸收变化和转运分布规律。结果表明，吡虫啉在叶部富集程度明显高于根部，当达到吸收稳定状态时，吡虫啉在叶部富集程度约为根部的6倍。吡虫啉在生菜中的吸收和代谢是同步进行的，代谢物在生菜叶部的富集程度排序为：吡虫啉烯烃>5-羟基吡虫啉>4，5-二羟基吡虫啉>6-氯烟酸>吡虫啉脲，代谢物在叶部富集高于根部。结果表明吡虫啉从根部向地上部迁移能力较强，根部施用吡虫啉可有效防治叶部害虫。本研究为吡虫啉的科学使用，保障农产品的质量安全提供了必要的数据支持。

关键词 吡虫啉; 生菜; 吸收; 转化

中图分类号： X592

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021070

Abstract In order to explore the uptake and translocation of imidacloprid in plants， lettuce was exposed to 1 mg/kg of imidacloprid in hydroponic solution for 120 h. The uptake and translocation of imidacloprid and its five metabolites in lettuce were determined by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The results showed that the accumulation of imidacloprid in leaves was significantly higher than that in roots. When reaching uptake quasi-equilibrium， the accumulation of imidacloprid in leaves was about six times of that in roots. The uptake and metabolism of imidacloprid in lettuce co-occurred， and the concentrations of metabolites in leaves ranked from high to low as followed： imidacloprid-olefin， 5-hydroxy-imidacloprid，4，5-dihydroxy-imidacloprid， 6-chloronicotinic acid， and imidacloprid-urea. The concentration of metabolites in leaves was higher than that in roots. These results suggested that imidacloprid had a better translocation ability from roots to the aboveground， and thus application in roots could effectively prevent and control leaf insect pests. This research provided essential data to support the scientific use of imidacloprid and ensure the quality and safety of agricultural products.

Key words imidacloprid; lettuce; uptake; transformation

吡蟲啉是拜耳公司生产的首个氯代烟碱杀虫剂，通过作用于昆虫的乙酰胆碱受体，扰乱神经活动达到杀虫效果，具有触杀和胃毒双重作用[1]。作为全球首个商品化的新烟碱杀虫剂，自1991年投放市场以来，已在120多个国家登记使用[23]。因其具有高水溶性和优良的内吸传导性，除喷雾施用外，吡虫啉也常用于种子及土壤处理[45]。与叶面施药不同的是，吡虫啉施用于土壤并被植物吸收，会代谢成具有杀虫活性的化合物，且代谢完全取决于植物种类和时间[67]。因此，研究吡虫啉在植物体内的吸收转运规律对其合理使用和农产品安全评价有着重要意义。

生菜是一种重要的全球内广泛种植的蔬菜，2016年生菜全球总产量超过2 500万t，其营养价值较高，不仅味道鲜美，还具有改善肠胃功能、护肝、降脂等药用功效[810]。近年来，生菜成为水培蔬菜的主要栽培品种[11]。在其生长过程中时常受到蚜虫的威胁，为保证生菜的产量不可避免地会使用农药[12]。吡虫啉可有效抑制蚜虫的发生。然而，对于吡虫啉研究大多关注于其环境毒理和残留监控，对于其在水培蔬菜中的吸收代谢报道较少[1315]。为全面了解吡虫啉对水培蔬菜的安全风险，本研究探究了吡虫啉在水培生菜中的吸收转运行为及其代谢物的分析，以期为水培蔬菜上吡虫啉的合理使用和安全评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试标准品99%吡虫啉，98.7%吡虫啉烯烃，99.7%吡虫啉脲，98% 5-羟基吡虫啉，98% 4，5-二羟基吡虫啉，99.2% 6-氯烟酸，购自北京金天然科技发展有限公司;供试植物为‘罗马生菜’，种子购自中蔬种业科技（北京）有限公司;氯化钠、无水硫酸镁、甲酸、乙腈，国药集团化学试剂有限公司;N-丙基乙二胺（PSA，40 μm）、石墨化炭黑（GCB，40 μm）、Filter Unit滤膜（0.22 μm），天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 试验设计

生菜种子以蛭石为基质进行育苗，待生菜长出2片真叶后，洗去蛭石，将其移入霍格兰营养液（四水硝酸钙945 mg/L，硝酸钾506 mg/L，硝酸铵80 mg/L，磷酸二氢钾136 mg/L，硫酸镁493 mg/L，七水硫酸亚铁5.56 g/L，乙二胺四乙酸二钠7.46 g/L，碘化钾0.83 g/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸锰22.3 mg/L，硫酸锌8.6 mg/L，钼酸钠0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025 mg/L）中，待生菜生长至6叶期，转移到1 L含1 mg/kg吡虫啉的霍格兰营养液中进行暴露试验，同时设置不含吡虫啉的对照组和不含生菜的对照组。培养条件：光周期L∥D=16 h∥8 h，光照强度250 μmol/（m2·s），温度为25℃，相对湿度为60%，pH为6.5。分别在暴露后2、6、12、24、48、72、96 h和120 h后采集样品，各3个重复。用蒸馏水冲洗根部表面的吡虫啉残留，用滤纸吸干后，将每个植株分割为根部和叶部，放置于-20℃冰箱保存，待测。

1.3 测定方法

提取：准确称取生菜根或叶均质样品1.00 g，并量取水培液样品1 mL，置于10 mL聚四氟乙烯离心管中，加入2 mL质量浓度1%的甲酸乙腈，以2 500 r/min涡旋提取10 min。然后加入1.0 g NaCl，以2 500 r/min涡旋5 min，最后以4 000 r/min离心5 min，待净化。水培液样品上清液直接过0.22 μm有机滤膜，无需净化。

净化：对于根部样品，移取1.2 mL离心后的上清液（乙腈层）至装有50 mg PSA+150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中;对于叶部样品，移取1.2 mL离心后的上清液（乙腈层）至装有50 mg PSA+10 mg GCB+150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，2 500 r/min 涡旋1 min，再以5 000 r/min 离心5 min后，将净化过的上清液过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS检测。

检测：采用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪ACQUITY UPLC-TQS（Waters公司）进行样品检测，采用电喷雾离子源，正离子电离模式（ESI+），其中离子源温度150℃，毛细管电压3.5 kV，去溶剂温度500℃，去溶剂气（N2）流量650 L/h，锥孔反吹气（N2）流量50 L/h。采用多重反应监测（MRM），具体参数见表1。色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;柱温：30℃;流动相：0.2%甲酸水溶液、乙腈：流速0.3 mL/min;进样量：5 μL;梯度洗脱条件见表2。

1.4 数据分析

吡虫啉在生菜中的吸收速率：

式中，k为单位时间的吸收速率常数[μg/（kg·h）]，ta和tb为时刻a和b，Ca、Cb分别表示吡虫啉在a和b时刻在生菜中的累积量。

吡虫啉在生菜中的富集程度，用根部富集系数和转运系数来表示：

式中，RCF为根部富集系数（root concentration factor，RCF），TF为转运系数（translocation factor，TF），Cwater为吡虫啉在水培液中的含量（μg/L），Croot为吡虫啉在根部的含量（μg/kg）。Cleaf为吡虫啉在叶部的含量（μg/kg）。

数据采用Excel 2019处理，并用Origin 2017作图。

2 结果与分析

2.1 建立吡虫啉及其代谢物UPLC-MS/MS检测方法

采用1.3的检测方法，浓度在0.005～1 mg/L范围内吡虫啉及其代谢物的峰面积与其浓度均呈现良好的线性关系，决定系数R2均大于0.99。在水培液中添加0.005，0.05 mg/L和5 mg/L吡虫啉及其代谢物，在生菜根和叶中分别添加0.005，0.05 mg/kg和5 mg/kg吡虫啉及其代谢物，其添加回收率均在85.51%～103.01%，相对标准偏差为6.13%～18.31%。符合农药残留分析条件。吡虫啉及其代谢物在各基质中的定量限（limit of quantitation，LOQ）为0.005 mg/kg。

2.2 生菜不同部位吡虫啉的吸收和累积动态

生菜对吡虫啉的吸收动态如图1所示。初始暴露2 h时，吡虫啉在根部累积量为（471.16±19.14） μg/kg，6～12 h，吡虫啉在根部的吸收速率k达到最大，为19.88 μg/（kg·h），随后吸收速率逐渐降低。在2～120 h内，吡虫啉在根部累积量为142.87～516.15 μg/kg，在120 h的累积量达到最大。在叶部，吡虫啉的富集程度随暴露时间增加逐渐升高，在120 h的累积量达到最大，为（3 098.75±114.82） μg/kg。在72～96 h吡虫啉在生菜叶部的吸收速率最大，为73.13 μg/（kg·h）， 是根部最大吸收速率的3.68倍。在120 h吡虫啉在葉部残留累积量为根部的6倍。

2.3 吡虫啉在生菜中的富集和转运

吡虫啉在生菜不同部位的富集和转运能力由根部富集系数和转运系数来表征。如表3所示，吡虫啉的根部富集系数和转运系数随暴露时间的增加整体表现为逐渐增高。然而，在暴露时间少于120 h时根部富集系数均小于1。0～120 h根部富集系数在0.23～1.00之间;转运系数范围为0.06～6.83，在暴露时间少于24 h时转运系数均小于1，随后转运系数大于2。吡虫啉在生菜中吸收和转运在暴露96 h时达到相对稳定状态，平衡后的RCF≈1，TF>6。

2.4 吡虫啉5种代谢物的动态变化

吡蟲啉在生菜中的代谢途径如图2所示。5种代谢物在生菜中随时间的动态变化如图3所示。吡虫啉脲在根部未检出但在叶部有检出。在根部检测到的4个代谢物的累积量表现为先降低后升高最后趋于稳定的特征。在叶部，代谢物吡虫啉烯烃、5-羟基吡虫啉、4，5-二羟基吡虫啉和6-氯烟酸的累积量均随时间增加逐渐升高，而吡虫啉脲则是呈现先升高，随后逐渐降低并趋于稳定。吸收达到相对稳定状态时（96～120 h），相对于其他代谢产物，吡虫啉烯烃在根部和叶部富集程度均为最大。在生菜根部，4种代谢物吡虫啉烯烃、4，5-二羟基吡虫啉、6-氯烟酸和5-羟基吡虫啉累积量分别是10.77～12.73、7.44～10.50、5.71～6.14 μg/kg和4.32～6.81 μg/kg。在叶部5种代谢物吡虫啉烯烃、4，5-二羟基吡虫啉、6-氯烟酸、5-羟基吡虫啉和吡虫啉脲累积量分别为11.75～29.66、13.64～17.42、7.28～14.82、8.47～23.43 μg/kg和7.67～11.01 μg/kg。

3 讨论

本研究建立了吡虫啉及其5种主要代谢物在生菜根、叶和水培营养液中的残留分析方法，LOQ均为0.005 mg/kg，相对于董见南等[16]建立的3种芸薹属蔬菜中吡虫啉残留分析方法（LOQ为0.02 mg/kg），灵敏度更高。梁秀美等[17]基于QuEChERS方法对茶花花粉中的吡虫啉及其3种代谢物吡虫啉烯烃、吡虫啉脲和6-氯烟酸进行了2次提取。本研究提取方法仅为1次提取，方法简单，且监测的代谢物更多。

吡虫啉在生菜各部位中的富集程度随着暴露时间的增加而升高，在暴露120 h时，吡虫啉在根部和茎叶部的累积量均达到最大，且在叶部的吸收速率和累积量均大于根部。在水培生菜体系中，吡虫啉在叶部的累积量约是根部的6倍。吸收稳定时，吡虫啉的RCF≈1，而TF>6，说明吡虫啉极易向地上部迁移。农药的根部吸收被认为是一个被动过程，吡虫啉具有较强的水溶性，其logKow为0.57，在根部可在极短时间内达到吸收稳态[18]。木质部是农药迁移和转运的重要组织，蒸腾拉力是水分等在木质部运输的主要动力，由于吡虫啉较高的水溶性，很容易随蒸腾作用进入木质部进而向叶部转运[19]。

在本研究中，吡虫啉代谢物在水培生菜叶部富集程度排序为：吡虫啉烯烃>5-羟基吡虫啉>4，5-二羟基吡虫啉>6-氯烟酸>吡虫啉脲。Wu等[20]指出灌根条件下，吡虫啉烯烃在棉花根、茎、叶、花蕾和棉铃上的累积量远高于吡虫啉脲和6-氯烟酸。Juraske等[21]指出相对于茎叶喷雾，根部施药其在植物中的分布更均匀。吡虫啉根部施用比茎叶喷雾对蚜虫和粉虱防治效果更好[2223]。根部施用的吡虫啉被植物吸收后，可以在植株体内转化为比母体毒性更高的代谢物[2425]。Dai等[26]提出吡虫啉烯烃具有比母体更高的杀虫活性。Nauen等[24]发现吡虫啉烯烃对棉蚜的胃毒毒性是吡虫啉母体的16倍。本研究结果表明，5种代谢物中，吡虫啉烯烃在生菜叶部的富集程度最高，该结果为吡虫啉生菜害虫的防治提供理论基础。

4 结论

本研究在水培条件下探究了吡虫啉在生菜中的吸收迁移与转化行为，结果表明吡虫啉吸收和代谢两个过程是同时发生的。吡虫啉具有较强的地上迁移能力，通过根部施用可有效防治叶部害虫。吡虫啉对蚜虫的药效作用可能是吡虫啉及其高毒代谢物特别是吡虫啉烯烃共同作用的结果。吡虫啉的田间施用可采用低剂量包衣方式，既可以减少农药的使用量，还可以高效防治叶部害虫。本研究为吡虫啉的科学使用，保障农产品的质量安全提供了科学依据。

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（责任编辑：杨明丽）