基于整合药理学平台预测黄芩-黄连对溃疡性结肠炎的作用靶点*

肖戈 陆文洪

（湖南中医药大学第二附属医院 长沙 410005）

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）是一种慢性、特发性、非特异性的肠道炎症性疾病，常引起慢性炎症和结肠黏膜层损伤[1]，病变部位可累及整个结肠[2]，以腹泻、脓液、便血、体质量减轻等为主要临床症状，易反复发作，对患者的生活质量造成极为严重的影响[3]。流行病学调查发现，UC在亚洲人群中的年发病率约为6.3例/10万人，且发病率呈逐年上升[4]。由于目前对UC的病因和发病机制不明确，治疗仍以药物控制症状为主。中医学将UC归属于“脏毒、肠澼、泄泻、肠风、肠痈”等疾病范畴。中医认为湿热是本病发病的基本病理因素之一，在该病的发病和治疗过程中有重要影响[5]，因此中药治疗多以清热燥湿为主。大量研究表明中药有助于改善UC患者的临床症状，且中药联合西药能提高该病的治疗效果[6]。中药作为维持治疗药物在肠道炎症性疾病专家共识意见中也被推荐用于UC的治疗[7]。性味苦寒的黄芩-黄连是清热燥湿的经典药对，二者均入大肠经，擅于清除肠道湿热，在UC的临床治疗过程中，二者常常相须而用以增强药效。临床研究发现，葛根芩连汤[8]、半夏泻心汤[9]、黄连解毒汤[10]和芍药汤[11]均对UC有很好的临床疗效，而黄芩-黄连作为药对，是这些方药的主要药味组成。且基于数据分析显示，黄芩-黄连在炎性肠病的治疗中用药频次及药物关联度均较高[12]。然而，尚未有研究对黄芩-黄连药对治疗UC的有效成分和靶点机制进行报道。本研究基于网络药理学分析，对黄芩-黄连药对治疗UC的活性成分及靶点机制进行预测，为临床应用黄芩-黄连药对治疗UC及进一步实验探寻其作用机制提供理论依据。现报道如下：

1 数据库与分析方法

1.1 查找黄芩-黄连药对活性成分以及作用靶点将“黄芩”和“黄连”输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中进行查找，根据药动学（ADME）条件筛选出有效成分：选择口服生物利用度≥30%的有效成分，且其类药性必须≥0.18，同时根据疾病特点将人结肠腺癌Caco-2细胞渗透性设定为≥-0.4，按照设定参数进行筛选。同时在数据库中查找两味药物的targets，通过Perl软件对靶点信息进行筛选，以获得相应药物活性成分及相应的靶点信息。并通过Unitprot转化为统一的gene symbol。

1.2 黄芩-黄连药对治疗UC的关键靶点筛选 以“ulcerative colitis”为关键词，分别在GeneCard和PharmGk数据库中查找与UC相关的疾病靶点，同时利用R软件（V3.6.1）上加载的“Venn Diagram”程序包，分析出“黄芩”和“黄连”中有效成分和治疗UC疾病的共同靶点，从而获得“黄芩、黄连”治疗UC的关键靶点。

1.3 构建并分析“药物成分-靶点-疾病”网络 将筛选出的关键靶点和药物活性成分信息编辑成关系文件和属性文件，利用Cytoscape3.7.2软件将结果构建成药物成分-靶点-疾病的交互网络。节点为黄芩、黄连及其药物的活性成分、关键靶点及UC，边代表黄芩、黄连与其相应的活性成分、活性成分与相关关键靶点、靶点与UC之前的相互关系。

1.4 构建蛋白质相互作用 （Protein-Protein Interaction,PPI）网络 通常疾病有多种相关蛋白质分子，其在遗传网络、生物化学及信号转导方面的相关性称为PPI。在String数据库中导入筛选出来的“黄芩-黄连”药对治疗UC的潜在作用靶点，在数据库中将“medium confidence”设定为阈值，并将“Homo Sapiens”选择为研究物种，置信度选择0.4，其余参数选择默认值，分析获取蛋白互作关系。同时将TSV格式文件导出，采用Cytoscape3.7.2软件将其绘制成蛋白互作网络，通过节点大小反应degree值的大小，最终获得PPI网络图。

1.5 进行GO（Gene Ontology）功能和KEGG通路富集分析 分析获得的“黄芩-黄连”对UC治疗的潜在作用靶点，并将其导入至David数据库中，同样需选择人类为研究物种进行相关富集分析。GO富集分析主要从3个方面进行：生物过程、分子功能和细胞组成，并在KEGG数据库中将条件设置为P＜0.05、Q＜0.05，分析获得相关作用通路。从而分析出相关活性成分作用靶点显著富集的主要功能和相应通路，进一步明确分析“黄芩、黄连”治疗UC的可能作用机制。

2 结果

2.1 黄芩-黄连药对活性成分及作用靶点筛选结果根据条件在TCMSP数据库检索得到黄芩-黄连药对的活性成分共51个，靶点共631个，其中黄芩有效成分36个，靶点382个；黄连有效成分15个，靶点249个。

2.2 黄芩-黄连药对治疗UC关键靶点筛选结果以“ulcerative colitis”为关键词，在GeneCards和PharmGkb数据库中分别检索到相关基因4 622个和15个，删除5个重复基因后，最终得到4 632个UC相关基因。通过Perl软件最终筛选出黄芩-黄连药对和UC的交集靶点共136个，其中黄芩和UC的交集靶点66个，黄连和UC的交集靶点117个，黄芩、黄连和UC三者的共同靶点47个。见图1。

图1 黄芩-黄连药对与UC共同靶点的Venn图

2.3 “药物-成分-靶点”网络构建 在Cytoscape中导入黄芩、黄连两味中药，以及通过上述方法所得到的51个潜在活性成分及631个作用靶点，制作出“中药-成分-靶点”网络图。见图2。根据Degree值进行排名，统计前9位的靶点。见表1。

图2 黄芩-黄连药对治疗UC“药物-成分-靶点”网络图

表1 黄芩-黄连治疗UC的靶点数排名前8位成分信息

2.4 PPI构建结果 将查找到的数据导入Cytoscape3.7.2软件，构建PPI图。在PPI图中，节点色彩越明亮，或在同一种色彩下节点的直径越大，则说明该节点的Degree值越大。见图3。将Degree值排名前14位的蛋白绘制成条形图。见图4。前5个蛋白从大到小分别为肿瘤蛋白53（TP53）、丝/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、转录因子JUN、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）和肿瘤坏死因子（TNF）。表明这些蛋白质在“黄芩-黄连”药对治疗UC的过程中发挥重要作用。再将PPI分析结果中Degree值排名前20的蛋白靶点与该药对的有效成分进行网络构建，筛选靶点和活性成分节点之间边数越多说明两者的关联程度越高。根据Degree值进行排名，获得的活性成分中前8的依次为槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇、醋栗素、麝香草黄酮和5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮。见图5。

图3 “黄芩-黄连”治疗UC的PPI图

图4 “黄芩-黄连”药对治疗UCPPI前14位蛋白Degree值条形图

图5 “筛选靶点-成分”网络

2.5 GO富集分析 GO富集分析发现，依据Degree值排名，在2 226条“黄芩-黄连”治疗UC的关键靶点中涉及生物过程（BP）的条目中，前5的条目为脂多糖反应细菌来源分子反应、氧化应激、活性氧反应、细胞氧化应激。在细胞组分（CC）中，排名前5的依次为膜、膜微区、膜区、转录因子复合物和囊腔。血红素结合、核受体活性、转录因子活性-直接配体调节序列的特异性DNA结合和四吡咯结合是分子功能（MF）中前5的富集基因。见图6。

图6 “黄芩-黄连”治疗UC关键靶点基因的GO功能富集分析

2.6 KEGG富集分析及“通路-关键靶点”网络构建通过KEGG通路富集分析，共获得165条与UC相关的信号通路，前10条分别是：人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙肝病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和AKT/蛋白激酶b（PI3K-AKT）信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、丙型病毒、癌症中的蛋白多糖、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、人乳头瘤病毒和甲型流感病毒感染。见图7。通过Cytoscape3.7.2软件制作出这20条通路与相关基因的网络图。见图8。

图7 “黄芩-黄连”药对治疗UC作用靶点的KEGG富集分析

图8 “通路-关键靶点”网络图

3 讨论

黄芩和黄连均味苦性寒，为清热燥湿、泻火解毒之要药，同时二者归于肺经、脾经、胆经、大肠经和小肠经，因此黄芩配伍黄连，能使清热燥湿作用增强，可清泻上、中、下三焦之实热，且黄芩还入血分能凉血止血，从而减轻便血症状。朱丹溪在治疗湿热痢疾时指出：“脉大当清热，非芩连不能清”。在历代中医名方中，葛根芩连汤、半夏泻心汤、黄连解毒汤和芍药汤等均以黄芩配伍黄连，用以治疗“下利”等肠道疾病，同时现代研究也表明其均对UC有较好的临床疗效。然而，黄芩和黄连作为这些名方中的重要药对，且药理分析发现二者皆具有抗菌与免疫调节两大方面的作用[13]，符合UC治疗的需要。

本研究通过网络数据库筛选出黄芩-黄连药对的活性成分51种，通过“药物-成分-靶点”网络分析，筛选出黄芩-黄连药对治疗UC可能的主要活性成分为槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、金合欢素、千层纸素、苏荠苎黄酮、β-谷甾醇、巴马汀和5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮。同时通过PPI分析发现，UC治疗的主要蛋白靶点为TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF和RELA等119个，将前20个蛋白靶点与对应的化合物成分构建网络，分析发现，度值排名前10的分别是槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、醋栗素、麝香草黄酮、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮、β-谷甾醇、（2R）-7-羟基-5-甲氧基-2-苯基铬-4-酮和巴马丁。与前面筛选到的10种成分，取交集共得到6种成分，分别为槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇、5,7,4'-三羟基-8-甲氧基黄酮和巴马丁。说明此6种成分为黄芩-黄连药对治疗UC最可能的有效成分。

现代研究发现，UC的发病受多种因素相互作用的影响，包括免疫、感染及内部肠道微生物群等方面[14]。在对UC靶点蛋白进行PPI分析时，发现TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF是度值排名前5的关键靶点。TP53是一种分子量为53kDa的抑癌基因，与肿瘤的相关性最高，在UC癌变的患者中可检测到不同的TP53突变[15]。而黄芩黄连药对中的主要活性成分槲皮素通过甲基化可调控TP53表达，影响癌细胞的细胞活力，抑制UC癌变[16]，这可能是该药对防止UC发生癌变的重要作用机制。同时，TNF参与机体免疫调节过程，具有促炎作用，参与肠道炎症反应而介导UC发病[17]；c-JUN也是炎症反应的主要调节因子，在结肠炎症反应的病理过程中发挥重要作用[18]。而AKT1主要通过参与肠上皮细胞自噬来调节慢性肠道炎症[19]，黄芩中的千层纸素被证实能有效抑制PI3K/AKT的表达[20]。此外，MAPK是将细胞表面信号转导致细胞内部的重要信号通路，参与细胞的增殖、分裂和凋亡，同时能影响细胞因子和炎症介质释放，与UC发病机制密切相关[21]，药对中的主要活性成分黄芩素和汉黄芩素均对MAPK的表达有一定的调控作用[22]。

GO富集分析的结果表明，黄芩-黄连药对治疗UC通过作用于多种细胞组分参与生物过程，主要包括脂多糖、细菌来源分子的反应、金属离子及活性氧的反应，氧化应激及细胞氧化应激，凋亡信号通路及活性氧代谢的调控等过程。通过KEGG通路富集分析，筛选黄芩-黄连药对治疗UC涉及的信号通路主要集中在PI3K-AKT、MAPK、病毒感染（如人巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及卡波西肉瘤相关疱疹病毒）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化和癌症中的蛋白多糖信号通路等。到目前为止，实验研究已经证实本研究预测的黄芩-黄连药对中的部分主要活性成分能通过调节相关靶点通路的表达发挥对UC的治疗作用。如槲皮素具有良好的抗氧化能力，可有效抑制结肠炎性损伤[23]，且其还能通过抗炎机制改善结肠炎症[24]。巴马丁可通过调节肠道菌群及抗炎抗菌作用治疗结肠炎[25～26]。汉黄芩素能通过改善肠上皮屏障功能减轻结肠炎[27]；黄芩素可通过调节肠道菌群、短链脂肪酸以及调控MAPK通路抑制肠道炎症治疗UC[28～29]。同时，研究还发现槲皮素[30～31]和千层纸素[32]均能通过调控PI3K/AKT信号通路影响肿瘤细胞的活性，这可能是该药对影响UC向癌症转变的重要作用机制。然而部分通路，如AGE-RAGE等信号通路，与UC的发病是否有关，以及黄芩-黄连药对配伍能否通过调控相关通路治疗UC，仍然不得而知，需进一步验证。

本次网络药理学分析预测的黄芩-黄连药对治疗UC的主要活性成分中，二者均含有Degree值排名靠前的活性成分，且二者所含主要成分的重要程度相当。分析该药对主要活性成分治疗UC的最主要靶点通路，预测其发挥治疗作用与以下机理有关：（1）黄连中的槲皮素在UC的治疗过程中具有抗氧化、抗炎及抑制癌变等作用，巴马丁可调节肠道菌群，具有抗炎抗菌作用；（2）黄芩中的黄芩素、汉黄芩素、千层纸素等能有效调节UC肠道菌群，调控MAPK通路抑制炎症，并通过调控PI3K/AKT信号通路抑制UC癌变。同时，二者的主要有效成分已被证实对UC有很好的治疗作用。可见，黄芩和黄连相须而用和单味药物使用相比，会增加UC治疗的活性成分，并能增加治疗的靶点通路，从而可能提高治疗效果。因此，黄芩和黄连配伍是治疗UC的重要药对。

综上所述，黄芩-黄连药对UC的治疗作用主要体现在抗炎、抗氧化作用及抑制癌基因的表达等方面，具有“多组分-多靶点-多通路”等特点，可能主要涉及TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF等靶点及PI3K-AKT和MAPK等信号通路。然而由于本研究是基于现有数据库信息的分析，并无实验验证，接下来需要进一步实验研究以验证预测的黄芩-黄连药对治疗UC的作用机制，从而为该药对在UC的临床治疗应用中提供更充足的证据。