RASSF1A和SHOX2基因甲基化检测联合快速现场细胞学评价对肺癌的诊断价值

任雪珠，张树森，蔡志刚△，李海涛，许晓岚，齐天杰，李宏林

肺癌严重威胁人类的健康，其发病率及病死率均居恶性肿瘤的首位［1］。由于大气污染、人口老龄化等原因，我国肺癌发病率、病死率呈逐年上升趋势［2］，迫切需要寻找更快速、准确的检测方法以提高诊断准确率［3-4］。基因甲基化是常见的表观遗传机制，参与调控肺癌的发生、进展和转移［5-6］。RAS 相关区域家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）是重要的抑癌基因，通过与细胞结合来介导细胞凋亡，其启动子CpG岛高甲基化是RASSF1A基因失活的重要机制之一［7-8］。多项研究提示，RASSF1A 甲基化是包括肺癌在内的多种肿瘤诊断及预后的标志物［9-10］。矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）在骨骼、心脏和神经系统的发育以及胚胎的形态发生中发挥重要作用［11］。当病理细胞学不能确诊时，SHOX2甲基化检测可作为肺癌诊断的有效补充［12-13］。快速现场细胞学评价（cytological rapid on-site evalutation，C-ROSE）是指通过经气管镜肺活检（transbronchial lung biopsy，TBLB）、经支气管镜针吸活检术（transbronchial needle aspiration，TBNA）、经皮穿刺肺活检等介入方式指导取材技术［14］，进行快速标本质控并提高肺癌的诊断率［15］。本研究将RASSF1A 和SHOX2 甲基化检测同C-ROSE 联合分析，评估其在肺癌辅助诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2018 年12 月—2019 年11 月在河北医科大学第二医院诊治并行甲基化检测的疑似肺癌患者179例，术后有明确组织和（或）细胞病理结果。其中，病理明确诊断为肺癌58例，包括腺癌27例，鳞癌13例，小细胞癌5例，类癌2例，腺样囊性癌1例，肉瘤样癌1例，未定型9例。甲基化检测标本分别为肺穿刺活检9例，胸水11例，痰液1例，肺泡灌洗液158例。179例中共有114例（肺癌45例，肺良性病变69例）完成了C-ROSE检查。所有标本的使用均通过本院伦理委员会批准（批准号：2019-R287），患者本人均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 RASSF1A及SHOX2甲基化检测试剂盒购自上海透景生物科技有限公司。DNA 提取试剂盒购自天根生化公司；亚硫酸盐修饰试剂盒购自ZYMO RESEARCH生物公司。ABI7500 全自动荧光PCR 仪购自美国应用生物系统公司。迪夫快速细胞染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司，正置生物显微镜CX31购自日本奥林巴斯公司。

1.3 研究方法

1.3.1 不同标本RASSF1A 及SHOX2 基因甲基化检测 （1）肺泡灌洗液。由有经验的支气管镜操作医师完成，操作符合成人诊断性可弯曲支气管镜检查术应用指南（2019 年版）规范。于病变肺段注入37 ℃生理盐水20 mL，尽快充分回收灌洗液，重复2~5次，以回收率＞40%为合格标本。（2）经皮肺穿刺活检标本。CT引导下经穿刺枪获取组织标本，待C-ROSE检查样本合格后，留取组织标本置于10 mL无菌生理盐水待检。（3）胸水标本。于第1次胸腔穿刺时留取。（4）痰液标本。于住院次日清晨留取。标本采集后严格按说明书步骤执行DNA 提取及亚硫酸盐修饰，DNA 修饰完成后，按甲基化检测试剂盒步骤及判读方法完成实时荧光PCR 检测，SHOX2 和RASSF1A甲基化检测结果任意1项阳性即判读为阳性。

1.3.2 C-ROSE 检测 经支气管黏膜活检、TBNA、TBLB、超声支气管镜针吸活检术（EBUS-TBNA）、CT 引导下经皮肺穿刺活检获取的组织进行涂片，每例患者至少检测2张涂片。将获取的玻片置于迪夫A染液，浸泡20 s，取出并使用磷酸盐缓冲液漂洗，甩干后置于迪夫B 染液，浸泡20 s，再次使用生理盐水漂洗，吸水纸吸除残留水分，于显微镜下（×100）观察并拍照。由经验丰富的细胞学医师判读，以发现核异质细胞为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0进行数据分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，Kappa值评价甲基化和（或）C-ROSE 检测与病理诊断的一致性，列联系数评价甲基化检测、C-ROSE与肺癌诊断的关联程度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SHOX2 和RASSF1A 甲基化检测对肺癌的诊断效能分析 179例患者标本中甲基化检测的敏感度为77.59%（45∕58），特异度为80.17%（97∕121），Kappa值=0.550，见表1。

2.2 不同样本中SHOX2和RASSF1A甲基化检测与病理诊断一致性分析 肺穿刺活检标本准确率为88.89%（8∕9），肺泡灌洗液标本为79.75%（126∕158），胸水标本为63.64%（7∕11），痰液标本仅1例，两种方法检测一致。肺穿刺活检及肺泡灌洗液中甲基化检测与病理诊断具有较好的一致性。

Tab.1 Comparison of SHOX2 and RASSF1A methylation results with pathological diagnosis in 179 cases表1 179例SHOX2和RASSF1A甲基化检测结果与病理诊断结果对比

2.3 不同肺癌亚型中SHOX2和RASSF1A甲基化检测诊断效能分析 鳞癌及小细胞肺癌甲基化检测准确率分别为92.31%（12∕13）、100%（5∕5），肺腺癌甲基化检测准确率为66.67%（18∕27）。

2.4 C-ROSE 检测对肺癌的诊断效能分析 114例患者标本中，C-ROSE 检测的敏感度为75.56%（34∕45），特异度为95.65%（66∕69），两者诊断一致性尚可（Kappa值=0.753），见表2。不同介入方式、不同标本类型中C-ROSE脱落细胞制片均可判定是否为正常气道上皮或者异形细胞，见图1。

Tab.2 Comparison of C-ROSE results and pathological diagnosis in 114 patients表2 114例C-ROSE检测结果与与病理诊断结果对比

Fig.1 ROSE images based on different ways of intervention operation(Diff staining,×1 000)图1 不同介入取材方式的C-ROSE图像（迪夫染色，×1 000）

2.5 SHOX2 和RASSF1A 甲基化联合C-ROSE 检测对肺癌的诊断效能分析 114例患者标本中两者联合检 测的 敏感 度 为86.96%（39∕45），特 异度 为86.67%（60∕69），Kappa值=0.728，见表3。

2.6 SHOX2 和RASSF1A 甲基化及C-ROSE 与肺癌诊断的相关性 以列联系数评价患者性别、年龄、甲基化检测、C-ROSE与肺癌诊断的关联程度，可见甲基化及C-ROSE 与肺癌诊断具有显著相关性（P＜0.01），见表4。

Tab.4 Correlation between methylation test,C-ROSE and lung cancer diagnosis表4 甲基化检测及C-ROSE与肺癌诊断的相关性（例）

3 讨论

甲基化是迄今为止研究较深入的表观遗传调控机制，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为甲基胞嘧啶［16］。研究表明，DNA高甲基化是肺癌的标志之一，也是癌变的早期表现［17］。另外，甲基化也被认为是肺癌的治疗靶点，DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）如氮杂胞苷和地西他滨等药物已在进行药物实验及临床研究［18-19］。目前，有多种基因的甲基化改变被推荐为不同肿瘤的生物标志物，如谷胱甘肽巯基转移酶P1（glutathione s-transferase P1，GSTP1），结肠腺瘤样息肉蛋白（adenomatosis polyposis coli gene，APC）、RASSF1等［20］。

RASSF1A 启动子甲基化现象已在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中被发现［21-22］。魏慧君等［23］认为，非小细胞肺癌患者肺组织RASSF1A基因启动子甲基化率明显高于对照组（41.50%vs.5.58%），其中对照组包括正常组织、血清、支气管灌洗液等。Zhao等［24］通过Meta分析发现，淋巴结、支气管抽吸物、胸腔积液、血浆和肿瘤组织中的SHOX2甲基化检测结果诊断肺癌的总体敏感度为70%，特异度为96%。Shi等［25］对251例肺癌组织标本进行临床表现评价，其中SHOX2 和RASSF1A 的甲基化检测特异度为90.4%，敏感度为89.8%；同时定量分析表明，SHOX2甲基化程度与肺癌分期相关，但RASSF1A甲基化程度与肺癌分期无关，认为SHOX2 和RASSF1A 的甲基化可能在癌症进展中发挥不同的作用。目前，RASSF1A 和SHOX2 联合检测是一种较好的肺癌筛查和监测方法，具有较高的敏感度和特异度，尤其在疾病早期阶段［26］。在本研究中，RASSF1A 联合SHOX2 甲基化检测诊断肺癌的总体敏感度为77.59%，特异度为80.17%。不同标本的亚组分析中，肺穿刺活检及肺泡灌洗液标本中甲基化与病理诊断一致率较好，而胸水的一致率稍差，提示肺穿刺活检及肺泡灌洗液更适于作为甲基化检测的标本。在肺癌类型亚组分析中，小细胞肺癌和鳞癌中甲基化检测准确率明显高于肺腺癌。但现有文献只是针对肿瘤组织及正常组织的甲基化率进行对比分析，尚未明确指出不同类型的标本的肺癌亚型分析。笔者在临床工作中确有发现，肺小细胞及鳞癌的甲基化检测准确率高于腺癌，后续研究将继续扩大样本量，以深入探讨甲基化检测在不同肺癌亚型之中的准确性。

随着呼吸介入技术的发展，TBNA、EBUSTBNA、支气管超声下经引导鞘管肺活检术（EBUSGS-TBLB）技术得到更大范围普及，C-ROSE 技术逐渐被认可［27］。C-ROSE 不但可以减少活检次数，而且可以提高标本合格率及诊断准确率，在标本获取的操作中越来越重要［28］。C-ROSE涂片不干扰原组织标本量，可迅速对标本进行质量控制，掌握标本分流的方向。本研究进一步将甲基化检测与C-ROSE相结合，发现两者结合诊断肺癌的敏感度和特异度较单独甲基化检测明显提升，对比C-ROSE 敏感度亦有较大提升，具有良好的诊断效能。

组织病理的结果取决于取材组织的准确和足量，所以呼吸介入技术的熟练程度和方式的选择至关重要。C-ROSE的价值在于呼吸介入技术操作过程中迅速指导取材的准确性，在对一些外压型和外周肺结节病变取材时，C-ROSE 未必能得到阳性结果，组织病理的阳性回报更少。所以需要考虑更换取材方式，如通过TBNA、EBUS-TBNA、EBUS-GSTBLB 等来获取更高质量、更充足的标本，这对术者的呼吸介入技术要求较高。目前国内能开展比较全面的呼吸介入技术的医院有限，加之C-ROSE 只是将组织的脱落细胞涂于玻片上，在阅片时仅可见到单个独立的细胞，无法像组织切片或冰冻切片等观察组织立体结构，所以在结果的预判上具有一定的局限性。甲基化检测的大部分标本容易获取，降低了对基层医院的呼吸介入技术的要求，从而提高了诊断准确率。

综上，RASSF1A 和SHOX2 甲基化检测及CROSE 均具有较高的敏感度和特异度。两者结合将成为病理学诊断的有效补充，有助于进一步提高肺癌的诊断效能。