免疫新城疫活疫苗对大肠杆菌感染鸡群血清生化指标变化的影响

蔡 羲 林 琳 黄梅清 陈秀琴 郑 敏 江 斌＊

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013)

禽大肠杆菌病（Avian colibacilloisis）是指由部分或全部致病性大肠杆菌（E.coli）引起禽局部或全身性感染的疾病。致病性大肠杆菌可引起不同品种、不同日龄鸡发病， 同时又容易与其它病原发生共感染，造成家禽大量死亡或生产力下降，导致严重的经济损失。 随着集约化、规模化养禽业的发展，大肠杆菌病已成为严重威胁养鸡业的传染病之一， 病理剖检变化主要表现为心包炎、肝周炎、气囊炎。目前，防治该病主要依靠抗生素治疗， 但是由于抗生素的不正确使用，导致细菌产生耐药性，另外抗生素药物残留会造成更为严重的食品安全问题，威胁人类健康。疫苗接种有一定的效果， 但由于大肠杆菌抗原结构复杂，血清型众多，免疫不同血清型疫苗不能产生交叉保护，给该病的防控带来了较大的困难。笔者通过多年临床实践，对于“顽固性”大肠杆菌病，应用新城疫疫苗紧急免疫，能取得较好的防控效果，具体原因尚不清楚。通过对试验鸡人工感染大肠杆菌，鸡群发病后免疫新城疫疫苗，再检测血清某些生化指标，以期揭示患鸡免疫新城疫疫苗控制鸡大肠杆菌病的原理。

1 材料与方法

1.1 大肠杆菌菌株来源 福建省农业科学院畜禽疾病诊疗中心分离鉴定的FQ11 株。

1.2 试验仪器与试剂 全自动生化仪 （TBA40，日本东芝），722E 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），普通台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16G），塑料试管，微量加样器。 新城疫Lasota 弱毒活疫苗（Ⅳ系），青岛易邦生物制品厂生产，批号：20190911；总超氧化物歧酶（T-SOD）试剂盒、溶菌酶试剂盒，购自南京建成生物工程公司。S-S 琼脂培养基、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；TP、Alb 测定试剂和校准品均购自德赛诊断系统（上海）有限公司；质控品购自罗氏公司。

1.3 试验动物 选取由河北峪口禽业有限公司提供的同一批次30 日龄健康海兰褐蛋鸡50 羽， 根据本场免疫程序进行免疫，7、21 日龄进行鸡新城疫-传染性支气管炎二联四价活疫苗免疫， 随机分为空白组10 羽，对照组20 羽，试验组20 羽，正常饲喂，不添加任何药物。

1.4 攻毒试验 参照周秀红等[1]的方法进行攻毒试验，以平板计数法测定细菌含量，将最终细菌浓度调至1×108CFU/mL。 试验组和对照组胸肌注射攻毒FQ11 大肠杆菌混悬液0.2 mL/羽， 空白组胸肌注射生理盐水0.2 mL/羽。 各组鸡分别隔离饲养，连续观察3 周，每天详细记录鸡群发病、死亡情况，并对病死鸡进行剖检，从中分离病原并进行鉴定，以验证死鸡确系攻毒所致。

待部分鸡出现临床症状时， 每羽试验组鸡免疫新城疫Lasota 弱毒活疫苗（Ⅳ系）4 羽份。 分别于免疫后第 5 d、 第 10 d、 第 17 d 随机采集各组血样8 份，每份 5 mL，分离血清。

1.5 血清溶菌酶含量测定 用比浊法测定血清溶菌酶活性。操作方法及步骤严格按照试剂盒说明书，利用分光光度计分别测定空白对照、 标准管和样品测定管的透光度，每个样本均重复测定3 次。然后计算血清溶菌酶含量。 Lysin=SC×n×（UT-OT）/（STOT），式中 Lysin 表示血清溶菌酶含量（U/mL）；SC 表示标准管浓度；n 表示稀释倍数；OT 表示空白对照管透光度；ST 表示标准管透光度；UT 表示样品测定管透光度。

1.6 血清总蛋白、白蛋白测定 用全自动生化仪检测样品。总蛋白用双缩脲法测定，白蛋白用溴甲酚绿法测定，操作方法及步骤严格按照试剂盒说明书。

1.7 血清超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，操作方法及步骤严格按照试剂盒说明书。 显色后利用分光光度计测定OD550nm， 结果以亚硝酸盐单位（U/mL）表示。

1.8 数据统计分析 利用单因素方差分析 （oneway ANOVA，LSD） 进行显著性检验，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。 数据用平均值±标准差（SD）表示。

2 结果与分析

2.1 临床表现和剖检病变 鸡群接种后第3 d，对照组和试验组部分鸡食欲降低，翅下垂，羽毛蓬乱，反应迟钝，行动缓慢，消瘦喜睡，排黄绿色稀粪。部检对照组、试验组患鸡各1 羽，病变表现为心包炎、肝周炎、气囊炎。以患鸡心血、气囊及肝渗出液接种SS 琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂，37 ℃温箱培养24 h 后，均有典型的大肠杆菌菌落生长。 空白对照组鸡的内脏一切正常。 第4 d，试验组鸡滴鼻免疫新城疫 Lasota 弱毒活疫苗 （Ⅳ系）4 羽份， 免疫后第5 d、第 10 d、第 17 d 抽血化验。 试验结束时，试验组鸡死亡4 羽（主要发生在免疫后7 d 内），对照组鸡死亡10 羽（发生在整个试验期）。空白组鸡精神状态正常，未见发病、死亡情况。

2.2 血清中溶菌酶含量检测结果 由表1 可以看出，血清溶菌酶的含量随着日龄的增长有所提升。紧急免疫后，试验组溶菌酶含量高于对照组，免疫后第5 d，两者差异不显著（P＞0.05）；免疫后第 10 d，两者差异显著（P<0.05）。免疫后第17 d，两组差异不显著（P＞0.05），说明紧急免疫新城疫活疫苗后，显著提高了机体非特异性的免疫应答能力。

表1 免疫后血清中溶菌酶含量的变化

2.3 血清总蛋白、 白蛋白的变化 由表2 可以看出，人工感染5 d，对照组和试验组鸡血清总蛋白、白蛋白含量均低于空白组，差异显著（P<0.05），试验组血清总蛋白、 白蛋白含量高于对照组， 免疫后第5 d、第 17 d，两者差异不显著（P＞0.05）；免疫后第10 d，试验组与对照组的指标差异显著（P<0.05）。 说明紧急免疫， 一定程度刺激机体非特异性的免疫应答能力。血清溶菌酶的含量有所提升， 人工感染后血清溶菌酶含量显著高于空白组；紧急免疫后第10 d，试验组溶菌酶含量显著高于对照组。 说明新城疫活疫苗显著提高机体非特异性的免疫应答能力。

表2 免疫后血清总蛋白、白蛋白的变化

血清总蛋白是各种蛋白的混合物， 主要随着白蛋白和球蛋白浓度的变化而变化，本研究发现，人工感染大肠杆菌后，对照组和试验组血清总蛋白、白蛋白含量均极显著低于空白组。 这可能是由于临床症状常表现为“肝周炎”，肝细胞受到一定程度的损伤，造成血清总蛋白、白蛋白严重低于正常水平。这一结

2.4 血清中SOD 活性的变化 由表3 可以看出，人工感染5 d， 对照组和试验组血清SOD 含量均高于空白组，差异极显著（P<0.01），试验组与对照组间差异不显著（P＞0.05），免疫后第 5 d，血清 SOD 含量最高，免疫后第10 d、第17 d 三组指标比较接近，说明感染大肠杆菌后， 血清中SOD 含量快速提升，免疫新城疫活疫苗， 对血清SOD 值没有产生很大影响。

表3 免疫后血清中SOD 活性的变化

3 讨 论

溶菌酶是正常机体非特异性免疫防御机制的组成部分之一， 血清中溶菌酶主要由单核-巨噬细胞分泌释放的一种非特异性免疫物质， 主要通过破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4 糖苷键进行杀菌。 通过测定其在血清中的含量及其变动情况， 可作为了解机体免疫功能的一个重要指标[2-4]。 本研究发现，随着鸡日龄增长，果与张军等[5]报道的结果一致。 免疫后第10 d，试验组血清总蛋白、白蛋白含量显著高于对照组，说明新城疫活疫苗一定程度刺激机体非特异性的免疫应答能力。

在本研究中，对照组和试验组血清SOD 含量均极显著高于空白组，试验组与对照组间无明显差异；免疫后第5 d，血清SOD 含量最高，随后逐渐下降，接近正常水平， 可能由于大肠杆菌感染引发了机体的代偿应激，导致SOD 的表达升高以应对大肠杆菌对机体的侵袭。 组内不同时间点SOD 活性的波动性， 可能是机体抗氧化机制受大肠杆菌感染的实时调控所致。 人工感染后SOD 活性增强，提高了机体抗氧化能力和清除过氧化物的能力， 保护了细胞免受损伤，这种抗氧化调控具有协同性和时效性。这与GILL S S 等[6]报道的SOD 活性在多种胁迫条件下发生上调，过表达SOD 可以消除氧化胁迫的消极影响的结论基本一致。

本研究首次揭示了人工感染大肠杆菌后， 使用新城疫活疫苗紧急免疫后鸡血清溶菌酶、 血清总蛋白、血清白蛋白和血清SOD 的变化，这些参数是机体非特异性免疫情况的重要指标， 对无抗预防和治疗大肠杆菌病具有一定指导意义。