环磷酰胺对福建黄兔肝肾损伤的试验研究

王 燕 周建华 俞春英 杨燕燕 谢金东 钟秋明 王训立

（福建中医药大学 福州 350122）

在临床上，环磷酰胺作为抗肿瘤药物，广泛应用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤以及急性白血病和慢性淋巴细胞白血病等疾病的治疗。 但过量使用时，会产生剂量依赖性的毒性临床表现[1]。 环磷酰胺除了用于抗肿瘤药物治疗外， 也是常用的免疫抑制剂，因其价格低廉、效果良好而被广泛应用[2]。环磷酰胺在体内代谢过程中， 不仅直接作用于细胞产生严重的毒性作用，还对肝脏、肾脏、胸腺、脾脏等器官有明显的损伤， 人们也常常利用环磷酰胺的毒副作用，制备免疫抑制动物模型，获得良好的免疫抑制效果，从而用于不同目的的科学探索试验[3-4]。

本试验采用福建特有的家兔品种福建黄兔作为试验对象，通过注射不同剂量的环磷酰胺，观察其对福建黄兔肝、肾造成的损伤程度，为用环磷酰胺制备福建黄兔动物免疫抑制模型提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物 雌性福建黄兔18 只，体重2.0～2.4 kg，福建省连江玉华山自然生态农业试验场提供。

1.2 主要试剂与仪器 环磷酰胺、分化液、返蓝液购自上海源叶生物有限公司； 多聚甲醛购自兰杰柯扩建有限公司； 灭菌生理盐水购自福州海王福药制药有限公司； 酒精和二甲苯购自天津永大试剂有限公司；苏木素染液、伊红染液、中性树胶由中杉金桥公司提供； 石蜡由北京北化康泰临床试剂有限公司提供（熔点 56～58 ℃）。

光学显微镜产自日本奥林巴斯公司 （型号：BX51T-PHD-J11）； 多功能真彩色细胞图象分析管理系统由美国Media Cybernetics 公司提供 （型号：Image-Pro Plus）； 石蜡切片机为德国莱卡生产 （型号：RM2015）；电热恒温干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司（型号：DHG-9053A）；低温冰箱由美国赛默飞世尔科技公司生产（型号：HFU586）；移液器购自德国EPPENDOR 公司；恒温水浴箱由江苏太仓医用仪器厂生产（型号：DSHZ-300）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验动物及分组 18 只雌性福建黄兔饲养于普通级兔实验室，自由采食和饮水，黄兔购进后在福建中医药大学实验动物中心动物实验室适应性喂养7 d，随机分成6 组，分别为对照组和剂量组Ⅰ～Ⅴ， 每组3 只。 剂量组分别按环磷酰胺浓度20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg、100 mg/kg 腹腔注射，对照组腹腔注射灭菌生理盐水2 mL。 连续给药7 d，第8 d 解剖取材。 动物试验期间，严格按照普通级实验兔饲养管理标准操作规程。

1.3.2 试验动物行为观察 试验给药前和给药结束后第2 d 分别对动物称重。 试验过程观察动物的饮食、精神、外观、行为等状况。

1.3.3 样品采集及预处理 采样前12 h，动物禁食不禁水。 30%乌拉坦注射液（3.5 mL/kg 体重）耳静脉麻醉黄兔，解剖摘取肝脏、肾脏组织，剔除组织表面脂肪和附着物，生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干，再修成3～5 mm3近方形组织块， 置于4%多聚甲醛溶液固定，并在4 ℃保存备用。

1.3.4 石蜡切片制备流程 按常规石蜡切片制作技术，将样品（肝脏、肾脏组织）放入包埋盒内，在自来水下冲洗1 h；使用梯度乙醇常规脱水，即用75%、80%、95%、95%、100%、100%乙醇分别处理 1 h，然后分别在二甲苯Ⅰ中处理25 min 和二甲苯Ⅱ中处理25 min；将样品放入包埋模中，用石蜡封住，放入冷台待其冷却后取出； 取出包埋后的蜡块， 切片机切成 4～5 μm 厚的蜡片， 烘烤切片， 用二甲苯脱蜡处理。

1.3.5 H.E 染色操作流程 石蜡切片二甲苯脱蜡10 ～30 min → 无 水 乙 醇 Ⅰ 5 min → 无 水 乙 醇 Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ 5 min、 Ⅱ 5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→水洗1 min→Harris 苏木素液1～3 min→水洗→0.5%盐酸酒精分化液分化3～10 s→水洗→返蓝液反蓝5～10 min （注意观察颜色变化）→水洗1～3 min→伊红染液 3～5 min→95%乙醇Ⅰ 1 min、 Ⅱ 5 min →无水乙醇Ⅰ 5 min、Ⅱ5 min→二甲苯透明20～30 min→中性树胶封片。

1.4 数据分析 试验所得数据用x±s 表示， 使用SPSS18.0 统计软件进行数据比较；肝脏、肾脏组织石蜡切片，采用显微成像分析系统（CCD）进行拍照分析。

2 结果与分析

2.1 不同剂量环磷酰胺对黄兔体重、 行为的影响试验给药前和给药结束后第2 d 分别对动物称重，对照组注射前后黄兔体重（增加）差异极显著（P<0.01）。 给药组随着环磷酰胺注射剂量升高，体重下降越趋明显， 环磷酰胺浓度为20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg 时， 注射前后黄兔体重无明显差异 （P>0.05）；环磷酰胺浓度为80 mg/kg 时，注射前后黄兔体重（减轻）有显著差异（P<0.05）；环磷酰胺浓度为100 mg/kg 时，注射前后黄兔体重（减轻）差异极显著（P<0.01），见表 1。

表1 不同剂量环磷酰胺对黄兔体重的影响

2.2 不同剂量环磷酰胺对福建黄兔肝脏组织结构的影响 福建黄兔肝脏组织H.E 染色观察结果：与对照组（见图1A）相比，剂量组Ⅰ（环磷酰胺注射浓度为20 mg/kg）的肝脏组织结构没有变化，其中肝索结构轮廓清晰，肝血窦形态正常，肝细胞分布、着色均匀，门管区结构显示正常（见图1B）。剂量组Ⅱ（环磷酰胺注射浓度为40 mg/kg） 可见局部肝细胞出现轻度水肿和变性， 但未见有坏死和明显的炎症反应现象（见图1C）。剂量组Ⅲ（环磷酰胺注射浓度为60 mg/kg）的肝细胞索结构稍紊乱，局部肝细胞水肿变性，散在小片状肝细胞嗜酸性变，细胞核固缩或溶解（见图1D）。 剂量组Ⅳ（环磷酰胺注射浓度为80 mg/kg）的肝细胞索排列紊乱，大量肝细胞呈现水肿和空泡化病灶，产生小片状变性坏死，肝血窦出现扩张淤血，多见枯否细胞的现象（见图1E）。剂量组Ⅴ（环磷酰胺注射浓度为100 mg/kg）有大量肝细胞呈嗜酸性病变，出现大面积凝固性坏死（见图1F）。

图1 不同剂量环磷酰胺对福建黄兔肝脏组织结构的影响

2.3 不同剂量环磷酰胺对福建黄兔肾脏组织结构的影响 与对照组（见图2A）相比，剂量Ⅰ组的肾脏组织没有明显变化， 肾小球和肾小管上皮细胞也没有发现明显变化（见图2B）。剂量组Ⅱ出现肾小管上皮轻度变性， 肾间质也呈现轻度水肿现象 （见图2C）。 剂量组Ⅲ肾小管上皮发生变性，肾间质出现明显水肿，有大量渗出液淤积，炎症细胞发生浸润现象（见图2D）。 剂量组Ⅳ大量肾小管上皮变性，管壁明显变薄，管腔变大，肾间质呈现严重水肿、出血病症，肾小囊间隙明显变小（见图2E）。剂量组Ⅴ出现大量肾小管上皮细胞坏死、脱落现象，肾小管壁变薄，管腔扩张，间质表现水肿、渗出，大量肾小球缺血、萎缩（见图 2F）。

图2 不同剂量环磷酰胺对福建黄兔肾脏组织结构的影响

3 讨 论

不同品种品系的试验动物， 应用环磷酰胺制备免疫抑制动物模型， 其给药途径和给药剂量有所不同，对动物造成的损伤也存在差异。环磷酰胺在生物体内的代谢过程中， 在肝脏经肝细胞色素P450 酶系水解的主要物质有磷酰胺氮芥和丙烯醛[5-7]。 磷酰胺氮芥具有抗肿瘤作用， 而丙烯醛对机体的毒副作用较大，抑制机体骨髓生成以及造成生殖系统、肝脏和肾脏等器官、组织损伤[8]。 环磷酰胺对肝脏的损伤主要是可引起肝细胞坏死，肝小叶中心出现充血，并伴随氨基转移酶升高[9]。 付晶等[10]发现，环磷酰胺可导致雏鸡肝脏组织细胞内线粒体明显受损， 并发生细胞凋亡现象。 王怡菲等[11]报道环磷酰胺制备免疫抑制动物模型时，不仅对肝脏产生损伤，肾脏病变主要表现为不同程度的纤维增生和出血现象， 细胞空泡化和核固缩等。

外观体征行为观察发现， 环磷酰胺高剂量组（80 mg/kg、100 mg/kg）给药后期，动物精神萎靡、呆滞，食欲下降，体重明显下降，出现明显的肝肾受损症状， 如血尿； 环磷酰胺中剂量组 （40 mg/kg、60 mg/kg） 给药后期， 动物有出现食欲轻微下降现象，个别动物有血尿现象，表明肝肾受损；环磷酰胺低剂量组（20 mg/kg）及对照组动物精神状况、食欲未出现明显的反应。由此可见，不同剂量环磷酰胺对福建黄兔体重、行为等有显著的影响。

本试验结果表明， 不同剂量环磷酰胺可造成福建黄兔肝肾组织不同程度的损伤。 随着环磷酰胺注射剂量的不同，病变程度不同，即肝脏、肾脏组织的病变程度与环磷酰胺的注射剂量成正相关。 低剂量（20 mg/kg）环磷酰胺对福建黄兔肝肾组织形态无明显影响，高剂量（80 mg/kg 及以上）环磷酰胺可诱导福建黄兔肝细胞变性，严重坏死，同时可导致肾小管上皮变性，肾间质水肿、渗出，肾小管上皮坏死脱落，肾小球呈现缺血、萎缩等症状；二者病变均随剂量增加而加重。

该研究结果可为用环磷酰胺制备福建黄兔动物免疫抑制模型提供参考依据。