链球菌改进咪喹莫特诱导银屑病样皮炎动物模型的研究

刘承灵，王祎琳，张 璇，王婧宇，仁 丹，柏 佳，赵 华 解放军医学院，北京 0085； 解放军总医院第一医学中心 皮肤科，北京 0085； 解放军总医院医学创新部 医院管理研究所，北京 0085

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，主要表现为躯干、四肢散在分布境界清楚的鳞屑性红斑和丘疹。银屑病发病机制复杂，涉及遗传、自身免疫、环境等多方面因素[1-2]。银屑病严重影响患者生活质量，目前药物治疗无法根治，其机制研究以及治疗方法的探索与评价是关注热点。建立一种便捷、稳定且符合临床病理特点的动物模型非常重要。目前用于研究银屑病的动物模型大致分为自发动物模型、转基因动物模型、咪喹莫特(imiquimod，IMQ)诱导模型和移植模型，方法众多，各有优缺点，但都不能完全模拟人体银屑病的发病规律[3]。目前最常用的银屑病样皮炎动物模型为咪喹莫特诱导的动物模型，因其操作便捷、相对实用且皮损及病理表现与临床银屑病类似程度高而被广泛使用。但由于成功造模后维持时间短，在一定程度上影响疾病机制研究及治疗药物的效价评价[4]。因此一种相对稳定延长皮损持续时间的模型具有一定意义。临床上发现，链球菌可导致银屑病的发生及病情加重，通过链球菌激发免疫反应从而建立多种免疫相关炎症性疾病动物模型(如IgA肾炎、类风湿性心瓣膜炎、自身免疫性脑炎)已有报道[5-10]。故我们采用文献报道的感染链球菌的方式刺激小鼠诱发免疫反应[11-12]，期待可延长皮损的持续时间、加重银屑病的皮损表现，形成更加稳定的动物模型。

材料与方法

1 实验动物 C57BL/6 小鼠 45 只，雌性，SPF级，6 ～ 8 周龄，体质量 18 ～ 22 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，实验动物合格证号：110324210100639426。小鼠饲养于SPF级动物实验室，饲养期间自由摄食饮水，控制环境温度为18℃～24℃、相对湿度为 40% ～ 70%，明暗交替12 h。所开展的实验均经解放军总医院实验动物中心伦理审查委员会批准(伦理批号：2021-X17-67)。实验中涉及的方法均根据动物实验相关指南和法规进行。2 药品及仪器设备 二氧化碳恒温细胞培养箱(SANYO公司，日本)，麦式细菌比浊仪(齐威仪器有限公司，杭州)，普通离心机(安亭科学仪器厂，上海)，小动物气体麻醉机(玉研科学仪器公司，上海)，石蜡旋转切片机(辅光精密仪器有限公司，上海)，哥伦比亚血培养基(科码嘉有限公司，上海)，实验用异氟烷(上海玉研科学仪器公司，上海)，咪喹莫特乳膏(3M中国有限公司，上海)，医用黄凡士林(vaseline，VAS；解放军总医院药剂室，北京)，A族β溶血链球菌株(group A streptococcus，GAS；北纳创联生物技术研究院BNCC 3371100，北京)，磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS；普诺赛，武汉)，小鼠白细胞介素(interleukin，IL)-17、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 酶 联 免 疫 吸 附实验(ELISA)试剂盒(江莱生物公司，JL20250、JL20257、JL20268，上海)，Ki-67抗体(Abcam公司，ab15580，美国)。

3 银屑病模型的建立及小鼠分组处理 1)细菌准备：将A族β溶血链球菌株充分活化，铺满整个血培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中12 h后，进行显微镜下菌株鉴定。确定扩增成功后，从母板上取一接种环的细菌在新的肉汤液体培养基中继续扩增，然后置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。16 h后离心过滤收集液体培养基中的菌落，采用比浊法测定细菌的数目，用PBS溶液配置终浓度为 2 × 1010CFU/mL 的细菌溶液。2)动物准备：小鼠适应性饲养后按照随机数字表法分为链球菌组 (GAS + IMQ)、咪喹莫特组 (PBS + IMQ)和空白组 (PBS + VAS)，每组15只。实验开始时，每只小鼠背部皮肤用电动剃毛器刮除2 cm ×3 cm大小矩形毛发。造模第1天，链球菌组小鼠每只鼻孔接种配置好的细菌菌液，每侧5 µL，咪喹莫特组、空白组小鼠每侧鼻孔接种等量PBS溶液。3)动物处理：造模第3天起，空白组每日在小鼠背部涂抹医用凡士林；链球菌组、咪喹莫特组每日在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏62.5 mg/(2 ×3 cm2·d)后充分按摩，持续涂抹 21 d。每组在造模的第0、3、10、17、24天随机处死3只老鼠并留取皮损组织标本，背部皮肤组织用10%甲醛缓冲液常温保存。造模第24天采取摘眼球取血法留取每只小鼠血液标本 0.5～1 mL，3 000 r/min 离心15 min，取上清待测。

4 皮损评分 参考银屑病皮损面积及严重程度指数 (psoriasis area and severity index，PASI)评估皮损的严重程度。实验第3天开始，每日对皮损的红斑、鳞屑、厚度进行评分，并将3项得分相加得到总分。PASI评分标准：红斑，0分为无红斑，1分为红斑呈淡红色，2分为红斑呈红色，3分为红斑呈深红色，4分为红斑极深；鳞屑，0分为表面无鳞屑，1分为部分皮损表面上覆有鳞屑，2分为大多数皮损表面覆盖有鳞屑，3分为皮损部位几乎全部被鳞屑覆盖且鳞屑呈层状，4分为皮损部位全部被鳞屑覆盖；厚度，0分为皮损与正常皮肤齐平，1分为皮损较正常皮肤表面稍高，2分为皮损中等度隆起，3分为皮损肥厚且隆起明显，4分为皮损高度肥厚且明显凸起。各组总分取平均值绘制曲线。

5 小鼠皮损组织病理及大体观察 每日对小鼠皮损进行拍照留存，将留存的三组小鼠背部皮损组织固定于10%甲醛溶液中，经标本脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色。显微镜下观察组织病理形态。

6 ELISA 检测小鼠血清中 IL-17、IL-6、TNF-α 的表达 将获取的待测血清标本按照试剂盒的说明书进行细胞因子浓度的测定，在IL-17、IL-6、TNF-α细胞因子检测板中加入样本(稀释5倍)或对应的标准品并设置对照，加检测抗体孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入显色剂显色反应5 ～30 min后，加终止液使反应终止，10 min内在酶标仪设置参考波长 610 ～ 630 nm，检测波长 450 nm，测出各孔吸光度值，通过标准曲线计算样品中各细胞因子的含量。

7 免疫组化检测小鼠皮肤中 Ki-67 的表达 将留存的各组小鼠皮损组织石蜡切片脱蜡水化，封闭，加抗原修复液进行冷修复，一抗4℃孵育过夜。次日室温放置30 min后，先滴加反应增强液室温反应10 min，后滴加二抗，室温反应20 min，DAB 显色 5 ～ 8 min，苏木精复染 20 s，脱水，封片，显微镜观察Ki-67的表达情况。

8 统计学分析 采用 Graphpad Prism 8 和 SPSS 23.0进行统计分析和图片绘制，使用iViewer软件观察测量HE组织标本表皮厚度，使用Image J软件计算免疫组织化学染色标本Ki-67阳性细胞比例。观测资料均为计量资料，以±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠皮肤大体形态观察及皮损 PASI 评分 第0 ～ 3天三组小鼠皮肤均光滑平整(图1)。与空白组相比，链球菌组、咪喹莫特组小鼠在第4天即出现轻微鳞屑，皮肤微发红；随后鳞屑增多，皮损面积蔓延扩大，部分红斑表面覆厚重鳞屑，红斑颜色加深；PASI评分开始上升(图2)，链球菌组评分高于同期咪喹莫特组。链球菌组和咪喹莫特组小鼠第10天鳞屑布满背部皮肤，上覆厚重鳞屑，红斑呈深红色。皮损PASI评分达到顶峰。咪喹莫特组小鼠第10天后皮损鳞屑面积开始减少，厚度减小，红斑颜色减退，第17天鳞屑进一步减少伴少量淡红斑，第24天仅见部分菲薄的鳞屑。链球菌组第10 ~ 24天皮损保持较为稳定，同期皮损PASI评分均显著高于咪喹莫特组(P＜0.05)。

图1 小鼠实验造模第 0、3、10、17、24 天背部皮损情况Fig.1 Skin lesions of mice on day 0, 3, 10, 17, 24

图2 小鼠不同时间点背部皮损PASI评分(aP＜0.05，vs PBS+IMQ)Fig.2 PASI scores of dorsal skin lesions in mice at specific time points (aP＜0.05, vs PBS+IMQ)

2 小鼠皮肤组织病理及表皮厚度改变 第 0、3天链球菌组和咪喹莫特组小鼠皮肤结构大致正常。第10天链球菌组和咪喹莫特组表皮均明显增厚，伴角化不全、角化过度、炎性细胞浸润、颗粒层变薄、棘突延长等。第17 ~ 24天咪喹莫特组表皮厚度明显减小，链球菌组表皮厚度减小不明显。见图3、图4。

图3 小鼠实验造模第 0、3、10、17、24 天皮损组织病理 (HE，200×)Fig.3 Histopathological changes of skin lesions in mice on day 0, 3, 10, 17, 24 (HE, 200×)

图4 小鼠实验造模第 0、3、10、17、24 天表皮厚度比较 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.4 Comparison of epidermis thickness in mice on day 0, 3, 10,17, 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

3 实验第 24 天小鼠血清 TNF-α、IL-17、IL-6 表达水平 造模第24天，与空白组相比，链球菌组和咪喹莫特组小鼠血液中IL-17和IL-6、TNF-α含量均升高，且链球菌组均显著高于咪喹莫特组(P＜0.05)。链球菌组与空白组 TNF-α、IL-6 、IL-17 细胞因子水平差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5。

图5 实验第24天小鼠血清TNF-α、IL-17、IL-6表达水平 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.5 Expression levels of TNF-α, IL-17, IL-6 in sera of mice on day 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

4 造模第 24 天小鼠背部皮损组织 Ki-67 表达造模第24天，链球菌组小鼠皮肤基底层Ki-67阳性细胞百分率显著高于咪喹莫特组和空白组(35.23%±3.26%vs24.30%±4.23%、13.73%±1.50%，P均＜0.05)。见图6。

图6 实验第24天小鼠背部皮肤Ki-67阳性表达A:免疫组织化学染色(200×)；B:Ki-67阳性率(aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.6 Expression level of Ki 67 in mice dorsal skin of each group on day 24 A: immunohistochemistry staining (200×); B: Ki-67 positive percentage (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

讨 论

银屑病是一种T细胞介导的免疫性疾病，可见于任何年龄段人群，常反复发作，亚洲成年人发病率约为0.14%[13]。主要炎症通路为IL-23/Th17轴的异常激活。银屑病患者皮损中可见数量不等的中性粒细胞、树突状细胞和淋巴细胞等免疫细胞的浸润；在银屑病患者血清中可发现TNF-α、IL-6、IL-17等细胞因子明显升高，说明多种免疫细胞和细胞因子参与Th17为主的免疫反应[14-16]。银屑病动物模型主要分为转基因动物模型、咪喹莫特诱导模型、异体移植模型等。转基因模型皮损表达较为稳定，但不能很好地模拟银屑病的发病规律且造价昂贵；异体移植模型因造模困难，条件苛刻而受限[3]。目前研究银屑病主要采用咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎动物模型。咪喹莫特是一种Toll样受体激动剂，可特异性激活Toll-7/8受体，促进γ干扰素产生，刺激树突状细胞激活Th17细胞免疫反应从而模拟银屑病样皮损，皮损在第7天左右最严重，1周后逐渐消退，给研究带来不便[17-18]。Horváth等[19-20]使用小型斑贴器改良动物模型，该模型可减少咪喹莫特的使用量，有效减少药物经皮吸收后对动物全身的不良影响。修缓娟等[21]通过皮下注射IL-12和脂多糖的方法，延长银屑病小鼠模型持续时间。

GAS是一种革兰阳性球菌，可在人体扁桃体中大量定植。研究发现GAS感染引发的免疫反应与IgA肾炎、类风湿心瓣膜炎、自身免疫性脑炎等免疫疾病密切相关，链球菌感染诱导的上述疾病动物模型已被广泛应用[5-10]。Groot等[22]的大样本队列研究显示，链球菌的感染与点滴型银屑病发生和慢性斑块型银屑病症状加重相关，并可以通过抗感染治疗银屑病。GAS主要通过其菌壁上的超抗原如M蛋白、制热素蛋白、热休克蛋白以及细菌内的甲基化DNA等作为抗原刺激并诱发T细胞相关免疫反应[23-24]。Ferran等[25]发现链球菌可特异性激活皮肤淋巴细胞相关抗原T细胞产生Th1、Th17类型的细胞因子参与银屑病角质形成细胞的异常增殖。Wang等[26]研究证实链球菌可以通过激活Toll-2受体以及产生转化生长因子β从而激活Th17免疫反应，在细胞水平上证实感染链球菌后机体产生的免疫反应与银屑病发病通路高度类似。

本研究以链球菌感染小鼠从而改良银屑病样皮炎动物模型[11-12]，使其皮损表现更显著、更稳定，持续时间更长。从小鼠大体皮损、PASI评分、皮损组织病理及表皮厚度等可看出，感染链球菌的小鼠皮损持续时间延长，皮损表现更典型、更稳定。反映炎症程度的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17在链球菌组中明显升高，说明链球菌感染小鼠的炎症程度更为剧烈。Ki-67是一种反映细胞增殖程度的指标，是银屑病中增殖活性的经典标志物[27]。免疫组化结果显示，链球菌组小鼠基底层细胞增殖更活跃。综上提示链球菌可能通过角质形成细胞的异常增殖加重银屑病样皮损。另外本实验中还观察到银屑病样皮炎小鼠模型在连续涂抹咪喹莫特后皮肤颜色变黑，鼠毛生长更为旺盛，提示长期外用咪喹莫特可能对老鼠皮肤及毛发生长有影响，但有待进一步证实与研究。

本研究以链球菌感染的方式改良银屑病样皮炎动物模型，此前未见报道。对比传统模型，链球菌感染的银屑病样皮炎动物模型皮损表现更典型、更稳定，持续时间更长。但本研究未探讨其具体机制，亟待后期研究加以完善。综上，链球菌感染可改良银屑病样皮炎动物模型，可能是一种可行且具备良好效果的动物模型。