常见胆道疾病的胆汁微环境改变研究进展

吴 浪，张贯军，张大涯，陈升鑫，李明阳解放军医学院，北京 00853；解放军总医院第一医学中心 消化内科，北京 00853

胆汁大部分由肝实质细胞分泌，每日分泌800 ~ 1 200 mL，流经肝总管、胆囊管，储存于胆囊内并被浓缩，通过胆管排入十二指肠，以促进脂肪的消化和脂溶性维生素的吸收。胆汁盐的可用性和肝胆循环的完整性是调节胆汁的重要因素。胆汁作为联结肝、胆囊、胰腺、十二指肠生理器官的第三间隙液体，其自身存在一个稳定的微环境状态，由细胞间质及其中体液成分组成，参与细胞的生存。微环境的稳定对细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动至关重要，其成分发生异常改变可导致细胞病变，进一步引起疾病的发生发展。近年来，随着科研技术水平的进步，对于胆汁的各方面研究展现出突飞猛进的发展趋势，包括胆汁代谢、胆汁成分与疾病之间的病理生理机制、生理结构的改变对胆汁微环境的影响等。本文就胆道系统常见疾病和胆汁的相关研究进展进行综述。

1 胆汁微环境的改变与胆结石形成的关系

胆结石作为胆道系统的常见病与多发病，其形成受多种因素的影响，包括饮食、生活习惯、肥胖、体质量、遗传背景、人种差异等，且血清三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、总胆汁酸和总胆红素水平升高也被证实是胆结石形成的危险因素[1-2]。根据胆结石成分可分为胆固醇结石、胆色素结石、混合型结石三种类型。据现有的文献检索，人们对于胆结石形成的研究有上百年的历史，从理化特性到菌群成分的改变，都对胆结石的形成有着至关重要的作用。研究证实胆道疾病患者细菌感染率高，以单菌种为主，胆汁培养的结果以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主[3]。近30多年来，人们对于胆汁细菌与胆结石形成的研究逐步有了新的认识，由通过培养的方法检测胆汁中的细菌，到应用聚合酶链式反应-脱氧核糖核酸扩增技术，再到半自动细菌鉴定仪，后来发展到现在的宏基因组测序方法等，这一系列技术方面的进步使胆汁中细菌的检测率逐渐提高，不同成分结石中含有的菌群各不相同[4]，其中通过全基因组鸟枪法测序和16S rRNA测序的方法鉴定出了人类胆道中从未报道过的微生物菌群。近年来对于胆汁微生态相关结石的研究更加全面化，胆结石包括胆囊结石和胆管结石。在新的检测技术出现后，对于胆管结石胆汁微生态的研究有了更深的探讨，16S rRNA高通量测序分析表明胆管结石患者胆道细菌主要为变形菌门与厚壁菌门，其中肠杆菌科尤为丰富[5-6]。有研究表明胆道与十二指肠微生物群之间的组成差异不显著，在属水平上排名前3位的核心微生物群是埃希菌-志贺菌、梭杆菌和肠球菌[6]。胆管结石又分为初发胆管结石和复发胆管结石，复发胆管结石与胆管内菌群失调、细菌群落聚集改变、胆汁酸降低有关[7]。有研究从门、属、种水平上对初发胆管结石与复发胆管结石胆道细菌进行了比较[8-9]，证实了其细菌的丰度和优势菌群有差异，提示在门水平上复发性胆总管结石病患者的变形菌显著增高，初发组为厚壁菌门[8-9]。在属水平上，不同的研究有不同的结论，查秀芳等[8]认为初发组胆管结石患者胆汁中芽孢杆菌属与乳球菌属丰度高，复发组摩根菌属丰度高。而Ye等[9]认为复发组主要为埃希菌。有研究证实胆汁微生物群可能是由更复杂的因素形成，如饮食、生活方式、宿主免疫反应和(或)特定解剖结构，而不是仅由微生物群形成的。Oddi松弛括约肌可以改变胆汁微生物群[5,10]，有助于胆总管结石的复发，其细菌种类较无Oddi括约肌松弛者更富多样性，结石复发患者梭菌的丰度明显较高[10]。有研究认为胆汁中细菌的致病机制与β-葡萄糖醛酸酶、磷脂酶和尿素酶的作用有关，甚至细菌的黏液活动导致黏液凝固也能形成胆结石[11]，其致病机制与胆结石形成之间的关系值得进一步探究。

近年来发现胆汁中有机酸、炎症因子和蛋白水平的改变对胆结石形成有着关键影响，这可能为胆结石形成原因提供了不可或缺的理论依据。胰胆管反流诱导的胆囊胆汁中游离脂肪酸和三酰甘油的增加以及胆总管压力的升高影响着胆结石的形成[12-13]。有研究表明胆汁中IL-1β为非细菌性炎症反应状态下胆结石的形成提供了重要的依据，混合结石胆汁中IL-1β含量明显高于其他类型结石[14]。Rupp等[15]发现了胆总管结石的胆汁液中的91种蛋白质，大多数来源于细胞外间隙，与细胞黏附、补体系统和凝血级联有关。胆汁蛋白质中HSA和RBP水平的上调、PFN水平的下调以及黏蛋白4促进了胆固醇结石的形成[16-17]。这为胆结石的形成在蛋白组学层面上提供了有力的依据。虽已有大量的理论数据证明了胆结石形成与胆汁微环境之间密不可分的关系，但细菌感染、蛋白组学的改变等与胆结石形成之间的相互作用机制还有待进一步研究，这有助于为预防胆结石形成和治疗胆石症提供一定的科学根据。

2 胆汁微环境的改变与胆管癌发生的关系

胆管癌起源于胆管的上皮组织，为消化系统中致死率很高的恶性肿瘤之一[18]。胆管癌分为肝内、肝门和远端胆管癌，大部分患者以胆道梗阻引起胆汁引流不畅以及一系列表现为临床首发症状起病，包括腹痛、发热、黄疸、皮肤瘙痒等。对于影像学表现为胆道狭窄或扩张的患者，需鉴别良恶性，然而目前缺乏特异性诊断方法。临床上通过血液学肿瘤标志物、磁共振胆胰管成像、增强CT或增强MRI对疾病进行初步的诊断，但对于胆道恶性肿瘤的早期诊断仍存在很大局限性。为解决这一难题，不同研究从不同角度出发探究胆汁微环境的改变对胆道恶性疾病的诊断价值。

从微生态的角度出发，胆道恶性疾病中肺炎克雷伯感染率相对更高[3]。在肿瘤相关性黄疸中，绝大多数细菌存在于胆汁和(或)胰液中，最常见的致病菌为链球菌，在内镜干预前，胆管和胰管梗阻可能存在原始细菌病原体[19]。远端胆管癌患者与胆管结石患者的胆汁细菌存在差异，远端胆管癌患者胆汁中最占优势的门是变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，且芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、氯霉素门、晚孢菌门和普朗克菌门明显增加[20]。

蛋白质组学研究在胆道恶性肿瘤相关生物标志物方面也有一定进展。癌症衍生蛋白可通过肿瘤细胞的坏死和凋亡释放到胆汁中，并在恶性转化过程中提供有用的信息。虽然有研究证实血清和胆汁的CEA、CA19-9、VEGFR-3、TAC检测对区分恶性和良性胆道梗阻没有帮助[21]，但胆汁蛋白质组学谱有利于区分胆管良恶性疾病，这为通过胆汁中的生物标志物诊断胆管癌提供了有力的科学依据。相关研究表明 HSP27、HSP70[22]、SSP411[23]、S100P[24]、CEACAM6[25]、LCN2[26]、α1-抗胰蛋白酶[27]、TPD52和DNAJB1[28]等均有潜力作为胆管癌诊断的胆汁新型生物标志物。良恶性胆道疾病患者的胆汁中蛋白质丰度有差异，与良性胆道疾病患者相比，胆管癌患者胆汁中的免疫球蛋白κ轻链、载脂蛋白E、白蛋白、载脂蛋白-ⅰ、抗凝血酶Ⅲ、α1-抗胰蛋白酶、血清转铁蛋白、免疫球蛋白重常数µ、免疫球蛋白J链、补充C4-A和补体C3水平显著提高[29]。

为提高胆管癌的诊断价值，胆汁的研究也从宏观延伸到了微观。肝外胆管癌直接接触胆汁液并将癌细胞和凋亡小体转移到胆汁中。有研究使用基于实时聚合酶链反应的甲基化分析证实胆汁中脱氧核糖核酸甲基化标志物是检测肝外胆管癌的肿瘤生物标志物候选[30]，胆汁中的甲基化也可作为原发性硬化性胆管炎患者胆管癌早期检测和筛查方法[31]。并且胆汁中游离DNA和胆汁循环肿瘤DNA有可能成为胆管癌诊断的补充方法[32-33]。另外，微小核糖核酸可分为致癌性和肿瘤抑制性，肿瘤进展通过致癌性微小核糖核酸的表达升高或肿瘤抑制性微小核糖核酸的表达降低而加快。有研究表明胆管癌患者胆汁中细胞外miR-30d-5p和miR-92a-3p水平明显高于良性胆道疾病患者，二者成为鉴别胆管癌的潜在生物标志物[34]。最新的甲基化研究通过聚合酶链反应扩增并测序表明胆汁中miR-1247、miR-200a和miR-200b的甲基化可能有助于区分胰胆癌与良性疾病[35]。

作为肿瘤细胞生长的微环境，胆汁中含有相对大量由肿瘤细胞分泌的肿瘤相关蛋白、基因、外泌体等。外泌体携带参与细胞信号转导的蛋白质、微小核糖核酸、环状核糖核酸和核糖核酸。不同细胞来源的外泌体具有显著异质性，在许多生物过程中介导细胞间的通讯，在免疫调节、肿瘤转移、血管生成和疾病发生发展中发挥重要作用。鉴于这些特征，外泌体可作为癌症诊断和预后的生物标志物[36]。尽管胆汁中的外泌体研究仍处于初级阶段，但越来越多的研究已表明外泌体在胆管癌的诊断中扮演着极其重要的角色，最早的关于胆汁外泌体的研究显示了具有代表性的5种外泌体，包括miR-486-3p、miR-191、miR-1274b、miR-16和miR-484，这有助于确定一种标志物何时唯一地诊断胆管癌，对哪些样本有一致的诊断，以及哪些标志物互补以产生高预测性的多miR生物标志物，并且这些miR结合起来具有任何两个miR标记的最高预测值[37]。最近的一项研究报道，胆管癌患者胆汁源性囊泡中circ-CCAC1和hsa_circRNA_100364上调[38]。基于这些方面的研究，胆汁中各种微成分的改变对胆道恶性肿瘤的早期诊断都有指导及借鉴意义，这为胆管癌靶向药物的研发提供了新的更有说服力的理论依据。

3 胆汁微环境改变对原发性硬化性胆管炎的诊断价值

原发性硬化性胆管炎 (primary sclerosing cholangitis，PSC)是指肝内和(或)肝外胆道系统内胆管发生炎症、纤维化及狭窄。胆汁可作为胆汁样细胞的来源，胆汁样细胞可在体外作为3D类器官长期维持，这些胆汁源性器官有对炎症刺激做出反应的能力。据推测，胆汁中促炎介质的存在可能反映了胆管细胞的持续炎症损伤，导致纤维化的发生[39]。在诊断方面，PSC易与胆管癌和其他胆道炎症狭窄混淆，胆汁微环境改变对PSC的诊断亦提供了一定价值。有研究通过对胆汁细菌16S rRNA基因的V1~V3区进行DNA分离、扩增和Illumina MiSeq测序，发现PSC患者胆汁中常见的门是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门和放线菌门[28]；最常见的科是普氏菌科、链球菌科、韦氏菌科、梭杆菌科和巴氏杆菌科；最常见的属是普氏菌属、链球菌属、韦氏菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属。且原发性胆汁性肝硬化的病因学与胆汁微生物群落的变化无关，但链球菌属可能在疾病的进展中起致病作用。另有研究表明胆汁中含有不同于口腔、十二指肠液和十二指肠黏膜的微生物群[40]。PSC患者与胆总管结石和乳头状瘤患者均含有以链球菌为主要属的不同核心微生物组，然而PSC患者胆汁中生物多样性降低，病原体粪肠球菌增加，胆汁中肠球菌的丰度与有害的次级胆汁酸牛磺胆酸浓度密切相关，且胆汁生物失调与促炎剂和潜在致癌剂牛磺胆酸浓度升高有关。

胆汁中蛋白质组学和代谢组学的研究在PSC方面亦有一定程度的进展。通过蛋白质组学方法确定PSC患者的胆道蛋白标志物，与无炎症或恶性迹象的对照组相比，PSC患者胆道S100A9表达升高95倍[41]，胆汁蛋白质组也显示出与炎症和先天免疫反应相关的疾病特异性变化[15]。疾病活动度高的PSC患者的S100A9表达较疾病活动度低的患者显著升高[41]。胆道S100A9水平可能是PSC活性的标志物，其在炎症和癌变中的作用值得进一步研究[41]。有研究通过二维差异凝胶电泳检测PSC患者相对于胆囊癌患者的过表达蛋白质，并通过液相色谱-质谱鉴定，共有101种蛋白在PSC患者的胆汁液中过表达，但未在胆总管结石患者的胆汁液中过表达，其中大多数被预测为细胞内蛋白质，并与核糖体和蛋白酶体途径相关[15]。与炎症和先天免疫反应相关的蛋白质，如分化簇14、膜联蛋白-2和补体系统的成分，在PSC中上调。从代谢组学分析PSC患者胆汁的特征，发现PSC的胆汁中富含二肽和多胺代谢物[42]，这些代谢物在非胆汁淤积性肝病中更加均匀。胆汁中蛋白质组学和代谢组学的改变有望为PSC患者提供早期诊断信息，有助于未来治疗药物的研发。

4 结语

胆道系统疾病相关领域的各种研究层出不穷，不同疾病胆汁中的优势菌群与菌群丰度存在差异，致病性菌群及益生菌对胆汁的影响有各自的作用机制，蛋白质、代谢物的成分与含量因疾病而异。外泌体作为双层脂质膜结构的囊泡，不同来源外泌体的靶向性和功能可能有所不同[43]。在炎症环境下，外泌体可促进细胞的增殖和迁移[44]，且与肿瘤发生、转移有密不可分的关系[45-46]。近年来，技术的更新使研究者能够从胆汁中提取外泌体，有关胆汁中外泌体的研究开始受到了越来越多的关注。

对于临床表现相同的胆道疾病，可有不同的病因，由于生理结构的特殊性，在取材和诊断方面有很大难度，导致在治疗时有时会很棘手。因此探索胆道系统不同疾病的微生态变化情况，有助于为疾病的诊断、治疗和预防以及靶向药物的研发提供科学依据。然而，胆汁微生态变化与胆道疾病发生的关系及致病机制还需要更加深入的探索，这也是未来我们解决问题的出发点之一。