大麻二酚对衰老小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响的体外细胞实验

李 琳，朱 彪，田萧羽，党瑞杰，赵立升，杨 烁，孙 磊，温 宁解放军医学院，北京 0085； 首都医科大学附属复兴医院 口腔科，北京 0008； 解放军总医院第一医学中心 口腔科，北京 0085； 中国人民解放军战略支援部队特色医学中心 口腔科，北京000

老年性骨质疏松是老年人常见的代谢性骨疾病，其造成骨质量下降，增加骨折风险并导致骨折愈合延迟，严重影响老年人生活质量[1]。正常生理状态下，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的自我更新和成骨分化是维持骨组织稳态及骨折修复的重要机制[2]。BMSCs与成骨细胞谱系间复杂的相互作用会受到年龄的影响[3]。研究表明衰老BMSCs的成骨分化能力逐渐降低，不利于骨组织的正常代谢和损伤重建[4]。因此，使用药物改善年龄相关的骨质疏松对维持骨代谢平衡具有重要意义。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是一种具有广泛生物学活性的大麻素类天然化合物[5]。体外实验发现，CBD可促进干细胞向成牙及成骨方向分化[6]。同时，CBD的干预可诱导细胞自噬，并决定了间充质干细胞在应激条件下的命运[7]。自噬过程对BMSCs成骨分化至关重要[8]，但CBD能否促进衰老状态下BMSCs的成骨分化仍不清楚。因此，本研究利用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)作用于小鼠BMSCs建立体外细胞衰老模型，研究CBD对衰老BMSCs成骨分化的影响，并探讨自噬在其中的作用，为CBD的临床应用提供实验证据。

材料与方法

1 细胞、试剂与仪器 5 周龄 C57BL/6 小鼠BMSCs(解放军总医院转化医学中心实验室)；CBD(CATO，美国)；D-gal(索莱宝，中国)；氯喹(chloroquine，CQ；Sigma，美国)；胰酶(Sigma，美国)；胎牛血清、α-MEM培养基(Gibco，美国)；PBS(Hyclone，美国)；成骨诱导液(赛业，中国)；CD11b、CD29、CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105抗体(BD，美国)；CCK-8试剂盒、RIPA、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒(碧云天，中国)；P62抗体(#5114；CST，美国)；LC-3B 抗体(Ab192890；Abcam，英国)；β-actin 抗体(BM0627；博士德，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(博士德，中国)；qRT-PCR试剂盒(Takara，日本)；细胞培养箱、酶标仪(Thermo，美国)；流式细胞仪(BD Celesta，美国)；蛋白电转、电泳设备(Bio-Rad，美国)；实时荧光定量PCR仪(FTC-3000P，Funglyn Biotech，加拿大)。

2 BMSCs的培养 复苏冻存的 5 周龄 C57BL/6小鼠BMSCs，接种于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基，置于含5% CO2的37℃细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长至80% ~ 90%时传代，并使用第 3 ~ 5 代细胞进行实验。

3 流式细胞术鉴定 BMSCs 第 3 代细胞正常培养2 d后，在培养皿中加入适量0.25%胰酶，终止消化后 l 000 r/min 离心 5 min 收集细胞。PBS 洗涤细胞3次后分别加入带有荧光标记的BMSCs表面标志物的抗体(CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105)。轻弹混匀后放置于冰上避光孵育30 min，PBS洗涤2次后重悬细胞，上机检测干细胞表面标志物的表达情况。采用FlowJo 10.4软件进行数据分析。

4 CCK-8 法检测细胞增殖 将第 3 代 BMSCs以3×103/孔的密度接种于96孔板，细胞随机分为对照组(Vehicle)、衰老模型组 (40 g/L D-gal[9])和CBD 干预组 (40 g/L D-gal + 2.5 µmol/L CBD)。细胞接种过夜后更换为含有 40 g/L D-gal或 40 g/L D-gal + 2.5 µmol/L CBD 干预的培养基，连续培养，每 2 ~ 3 d 换液，于接种后 1 ~ 10 d 每天检测细胞的增殖活力。测定时，按照CCK-8说明书，每孔加入 10 µL CCK-8 溶液并于 37℃ 孵育 2 h 后，使用酶标仪测量其在450 nm波长处的吸光度值。

5 Western blot检测 LC-3B 及 P62 蛋白表达 将第3代BMSCs以5×104/孔的密度接种于6孔板，细胞随机分为对照组(Vehicle)、衰老模型组(40 g/L D-gal)、CBD 干 预 组 (40 g/L D-gal + 2.5 µmol/LCBD)和自噬抑制组 (40 g/L D-gal + 2.5 µmol/L CBD + 20 µmol/L CQ[10])。细胞接种过夜后加药并加入成骨分化诱导液，成骨诱导培养7 d后用RIPA裂解液提取细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后定量30 µg蛋白上样并进行电泳及转膜，按照1∶1 000的浓度配置一抗P62和LC-3B并进行孵育，4℃过夜，次日二抗室温孵育1 h后使用显影剂观察条带上蛋白的表达情况。具体实验步骤参照文献[11]。

6 qRT-PCR 检测衰老及成骨相关基因的 mRNA表达 将第3代BMSCs以1×105/孔的密度接种于6孔板，细胞随机分为对照组(Vehicle)、衰老组(D-gal)和 CBD 干预组 (D-gal + CBD)，正常培养3 d后使用TRIzol试剂提取总RNA，测定RNA浓度后定量1 µg RNA为模板，反转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR仪检测衰老相关基因P16和P21的mRNA表达；将BMSCs以5×104/孔的密度接种于6孔板，细胞分组及处理同Western blot，然后使用qRT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runt相关转录因子 2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和骨钙素(osteocalcin，OCN)的转录表达。PCR 反应条件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 15 s，40 个循环。相关引物均由上海生工合成，引物序列见表1。

表1 衰老及成骨相关基因引物序列Tab.1 Primers sequences used for qRT-PCR

7 ALP 活性检测 将 BMSCs 以 5×104/孔的密度接种于6孔板，细胞分组及处理同Western blot。分别于加药后 1 d、3 d、5 d 和 7 d 按照 ALP 检测试剂盒的操作说明收集各组细胞裂解液，分别取50 µL 加入 96 孔板，37℃ 孵育 5 min 后加入 100 µL终止液终止反应，测量样品在405 nm波长处的吸光度值并计算各组的ALP活性。

8 统计学分析 使用 SPSS26.0 和 Graphpad Prism 9.0进行数据分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠 BMSCs 鉴定及体外衰老模型的建立 对复苏的小鼠BMSCs进行表面标志物鉴定，流式细胞术结果显示，P3代小鼠BMSCs高表达间充质干细胞表面标志CD29(99.27%)、CD44(98.04%)、CD73(96.66%)、CD90(99.26%)和 CD105(98.90%)，低表达造血及内皮细胞表面标志CD11b(1.11%)、CD31(0)、CD34(1.35%)和 CD45(0.98%)(图1A)。使用40 g/L D-gal作用于 BMSCs，qRT-PCR显示 D-gal处理后BMSCs的P16和P21 mRNA表达水平显著升高(P＜0.05)，证明D-gal处理成功建立了衰老BMSCs模型；而CBD干预后P16和P21的表达水平较D-gal组明显降低(P＜0.05)，提示CBD可明显改善D-gal诱导的细胞衰老状态(图1B)。

图1 小鼠BMSCs衰老细胞模型的建立A：小鼠BMSCs表面标志物鉴定；B：P16和P21的mRNA表达水平(aP＜0.05，vs Vehicle组；bP＜0.05，vs D-gal组)Fig.1 Senescence model of mice BMSCs A: surface markers of mice BMSCs by flow cytometric analysis; B: mRNA expression levels of P16 and P21 (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

2 CBD 促进衰老 BMSCs的增殖活性 CCK-8 法检测 D-gal及 CBD 处理后小鼠 BMSCs 1 ~ 10 d 的增殖变化。与正常增殖的空白对照组相比，D-gal诱导的衰老BMSCs从第4天开始增殖活力明显降低(P＜0.05)，而联用CBD则显著增强，从第5天开始与仅使用D-gal组有统计学差异(P＜0.05)，表明CBD可促进衰老BMSCs的增殖。见图2。

图2 CBD对衰老BMSCs增殖的影响(aP＜0.05，vs Vehicle组；bP＜0.05，vs D-gal组)Fig.2 Effect of CBD on senescent BMSCs proliferation (aP＜0.05,vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

3 CBD 激活衰老 BMSCs 中自噬相关蛋白的表达Western blot检 测 各 组BMSCs 中 自 噬 相关P62和LC3B蛋白表达情况。在D-gal诱导的衰老模型中，P62蛋白表达显著升高，LC3B-Ⅱ表达降低(P＜0.05)。而CBD干预显著提高了被D-gal抑制的LC3B-Ⅱ表达，同时降低P62蛋白表达(P＜0.05)，提示CBD可激活BMSCs的自噬活性。而在CBD干预组中再加入自噬抑制剂氯喹后，P62蛋白和LC3B-Ⅱ蛋白的表达均升高(P＜0.05)，表明自噬抑制剂氯喹抑制了CBD激活的BMSCs自噬。见图3。

图3 CBD对衰老BMSCs中自噬相关蛋白P62和LC3B表达的影响(aP＜0.05，vs Vehicle组；bP＜0.05，vs D-gal组；cP＜0.05，vs D-gal+CBD 组)Fig.3 Effect of CBD on protein levels of P62 and LC3B in senescent BMSCs (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

4 CBD 通过自噬增强衰老 BMSCs成骨相关基因的表达 qRT-PCR检测成骨相关基因的mRNA表达。与空白对照组相比，D-gal组中ALP、Runx2和OCN基因mRNA表达水平均显著降低(P＜0.05)，提示衰老BMSCs中成骨分化受到抑制。而CBD干预组ALP、Runx2和OCN的mRNA表达水平显著高于D-gal组(P＜0.05)，同时高于空白对照组(P＜0.05)。而当CBD激活的自噬被氯喹抑制后，CBD提高成骨相关基因mRNA表达水平的作用被显著抵消，表明CBD增强衰老BMSC成骨分化的作用在一定程度上是由激活自噬产生的。见图4。

图4 CBD对成骨相关基因转录表达的影响(aP＜0.05，vs Vehicle组；bP＜0.05，vs D-gal组；cP＜0.05，vs D-gal+CBD组)Fig.4 Effect of CBD on mRNA expression levels of osteogenesisrelated gene (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

5 CBD 通过自噬增强衰老 BMSCs 的 ALP 活性 经成骨诱导培养后，各组BMSCs随着时间生长，ALP活性逐渐增强。与空白对照组相比，D-gal诱导的衰老BMSCs组ALP活性受到显著抑制(P＜0.05)，而在 3 d、5 d 和 7 d 时，CBD 干预组BMSCs的ALP活性较衰老组显著增强(P＜0.05)。但当CBD与自噬抑制剂氯喹联用时，ALP活性显著降低(P＜0.05)。以上结果说明CBD增强衰老BMSCs的ALP活性的作用，与激活自噬明显相关。见表2。

表2 各组BMSCs的ALP活性检测Tab.2 ALP activity of different groups

讨 论

本研究通过使用D-gal构建衰老BMSCs模型，在衰老BMSCs中观察到CBD能够降低衰老相关基因P16、P21的表达水平，促进衰老BMSCs增殖，激活自噬相关蛋白，并促进成骨相关基因的表达，提高衰老BMSCs的ALP活性。加入自噬抑制剂氯喹后，CBD促进衰老BMSCs成骨分化的作用明显减弱，表明CBD通过激活自噬促进衰老BMSCs的成骨分化。

间充质干细胞具有多能性，其自我更新和成骨谱系分化是维持骨组织稳态和修复的重要基础[12]。在生理性过程中，BMSCs在细胞因子的激活下增殖并分化为成骨细胞和软骨细胞等，通过分泌细胞外基质维持骨代谢平衡[13]。在本研究中，我们首先通过流式细胞术对培养的小鼠BMSCs进行鉴定，发现其高表达间充质干细胞表面分子，证明我们成功培养了骨髓间充质干细胞。

P16和P21是细胞周期的负性调节蛋白，作为衰老标志物，是氧化应激等多重因素引发细胞衰老的重要机制[14]。研究表明CBD可降低衰老胰岛细胞中P16和P21的表达[15]。在本研究中，D-gal显著提高了BMSCs的P16和P21的mRNA表达水平，表明D-gal的干预成功诱导了BMSCs的衰老状态。而CBD的加入显著降低了D-gal引起的P16和P21表达升高，提示CBD在抵抗BMSCs衰老中的有益作用。

干细胞的增殖潜能往往会随着衰老的进程而逐渐减弱，并与骨质疏松的发生密切相关[16]。研究发现，老年小鼠BMSCs的增殖能力显著降低[17]。体外实验表明，CBD单独应用可促进BMSCs的活力[18]。在本实验中我们也观察到，经D-gal处理后的BMSCs，增殖活性受到明显抑制，而联用CBD则显著恢复了增殖活性，表明CBD可在一定程度上促进衰老BMSCs的增殖潜能。

自噬是细胞代谢的重要过程，能够通过溶酶体清除胞内异常物质而维持细胞稳态，且与细胞衰老关系密切[19-20]。研究发现，代表细胞衰老状态的P16和P53水平与细胞自噬水平呈明显正相关[21]。P62是细胞自噬的底物蛋白，与自噬的激活状态呈负相关[22]。当自噬激活时P62被利用，当自噬被抑制时P62蛋白在细胞内堆积[23]。LC3B是自噬的标志蛋白，当自噬激活时，胞质游离型LC3B-Ⅰ迅速转换为膜结合型LC3B-Ⅱ，进而促进自噬体的形成[24]。在本研究中，衰老BMSCs的P62蛋白表达升高，LC3B-Ⅱ水平较低，说明其自噬状态受到抑制。CBD干预降低P62表达水平，同时升高LC3B-Ⅱ表达水平，表明CBD能够激活自噬过程。氯喹是自噬过程的抑制剂，通过抑制自噬体与溶酶体的融合在自噬晚期发挥抑制作用[25]。因此氯喹干预后LC3B-Ⅱ的表达水平并不会降低。我们将CBD与氯喹联用，发现P62与LC3B-Ⅱ的表达显著增高，表明CBD激活的自噬被氯喹抑制，从反面证明了CBD对自噬的激活作用。

成骨分化能力下降是衰老BMSCs最重要的表现，与自噬抑制显著相关[26]。但CBD是否能通过自噬过程调控BMSCs成骨分化尚无实验证据。ALP和Runx2是BMSCs成骨分化早期的重要指标，而OCN主要表达于成骨后期[27]。研究表明在MG-63细胞中，CBD促进ALP和Runx2的表达并提高ALP活性[7]。我们首先通过qRT-PCR检测了BMSCs中ALP、Runx2和OCN的mRNA表达情况，结果显示经D-gal干预的BMSCs中三种基因的mRNA表达均降低，而联用CBD抵消了D-gal对成骨基因表达的抑制作用。同时，我们观察到ALP活性检测结果与qRT-PCR结果一致，CBD显著提高了被D-gal降低的BMSCs的ALP活性。可以推断，CBD可能在成骨的早期和后期具有持续的促进衰老BMSCs成骨分化的作用，而自噬抑制剂氯喹可部分对抗CBD促进成骨相关基因表达和提高ALP活性的效应。以上结果表明，CBD通过激活自噬进而促进D-gal诱导的衰老BMSCs成骨分化。

有研究发现，ROS水平升高、氧化应激和自由基损伤等是细胞衰老的重要机制[28]。而D-gal通过诱导细胞氧化应激损伤，包括ROS的升高，从而建立体外细胞衰老模型[29]。既往研究表明，CBD能够降低衰老胰岛细胞内的氧化应激应答和ROS水平[15]，因此衰老小鼠BMSCs中CBD促进成骨分化与细胞内氧化应激及ROS水平的关系值得进一步探讨。本研究存在一定的局限性，CBD对衰老小鼠骨质疏松的干预效果仍需体内实验的数据。

综上所述，CBD的干预可激活衰老小鼠BMSCs的自噬过程，这种激活作用能够促进衰老小鼠BMSCs成骨分化。CBD作为一种安全有效的药物，对衰老性骨质疏松的治疗潜力值得关注。