精神分裂症患者病情控制与肠道菌群结构的关系探讨

尹春蕾，刘荣荣，李丽娟，3*

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2.枣庄市疾病预防控制中心，山东枣庄 277000；3.大理大学澜湄人类健康研究中心，云南大理 671000）

精神分裂症是一种常见的重型精神疾病，累及世界1%的人口，其终身患病率为0.16%～1.21%〔1〕，伴有年龄和性别差异。该病多起于青壮年，以其思维、情感、人格和行为障碍的分裂，个性改变和精神活动与其环境发生不协调为主要特征，通常无智能和意识障碍，一些患者会有认知障碍。其病程多迁延，临床表现具有异质性，对患者的身心健康及社会生活质量产生严重影响，造成了巨大的经济压力和社会负担。随着生物学技术的不断发展，国内外对精神分裂症的认识在其疾病描述、发展规律、产生机制及防治领域等方面逐步深入。目前对于精神分裂症与神经发育和炎性免疫方面的研究关注较多。有研究者提出，肠道菌群可以调节人体的免疫炎性反应并影响神经发育，由此推测肠道菌群与精神分裂症之间可能存有某种关联〔2-3〕，然而，目前关于肠道微生物群与精神分裂症关系的研究仍然有限。本研究对有无精神疾病家族史的精神分裂症患者发作期和控制期的肠道菌群进行测定，并比较精神分裂症患者发作期和控制期两个阶段肠道菌群的差异以及精神疾病家族史对精神分裂症患者肠道菌群的结构是否有影响，初步探知其精神疾病家族史、精神分裂症患者病情控制与肠道菌群结构的分布是否有关联，了解精神分裂症患者症状得以控制后肠道菌群结构和多样性的变化情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象将2017年12月至2018年8月在大理白族自治州第二人民医院精神科住院，确诊为精神分裂症患者纳入研究，共60例，入组时均为发作期组；经过一段时间的治疗，患者病情得到控制后为控制期组。考虑精神分裂症的家族遗传特性，本研究依据患者不同病期（发作期、控制期）与有无精神疾病家族史将研究对象分为4组，分别是发作期有家族史组（1-1组）、控制期有家族史组（1-2组）、发作期无家族史组（2-1组）和控制期无家族史组（2-2组）。结合入院第一次采样结果，对不符合要求的患者给予剔除。剔除标准：①中途出院失访者；②合并患有肝胆胃肠道疾病、自身免疫性疾病及传染病等其他疾病者；③出院诊断与入院诊断不一致者。最终纳入研究患者共10例，男女各5例，有无家族史患者各5例。研究对象平均年龄为（39.70±9.11）岁，平均体质指数为（22.71±2.29）kg/m2。研究经大理大学医学伦理学会批准，所有入组者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与菌群提取 所有患者入院3 d内采集一次早晨新鲜粪便，进入控制期后再进行一次粪便采集，均由研究人员收集，分装，-80℃冻存。所有样本收集完毕后，进行实验室处理，包括DNA提取，PCR扩增及产物纯化。

1.2.2 基因测序 利用罗宁生物Hiseq 2500平台PE250模式上机测序。

1.3 数据分析测序数据分析包括序列处理、物种注释、群落组成分析、多样性分析和物种差异分析等。应用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据无特殊说明均用（x±s）表示。两组独立样本物种分析采用Wilcoxon秩和检验，多组独立样本物种分析采用Kruskal-Wallis H检验，P＜0.05为差异有统计学意义。多重比较分析调整P值，α=0.05/2n（n为比较组数）时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本测序结果通过高通量测序，20个样品共获得843 516条Raw PE序列，对序列进行质控得到Clean Tags（去除低质量数据）784 844条。使用UCHIME算法去除嵌合体，得到760 123条Effective tags（高质量有效序列）。对736 338条Effective tags在97%的一致性水平上进行聚类共获得1 756个OTUs（操作分类单元），其中，1-1组、2-1组、1-2组和2-2组中的OTUs数目分别为1 310、1 115、1 334和1 139个。各样品的操作分类单元和高质量有效序列数目见图1。

图1 各样品操作分类单元和高质量有效序列数目

2.2 肠道群落物种组成每个样品注释到各分类水平中通常包括界、门、纲、目、科、属、种。所有样品共注释了30个门，62个纲，118个目，178个科和322个属。本研究注释的绝大部分菌群主要分属于4个菌门：厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。厚壁菌门在4组样品中的相对丰度均最高，与拟杆菌门、变形菌门和放线菌门构成精神分裂症患者的优势细菌门。在纲水平上，患者肠道菌群中的梭杆菌纲、拟杆菌纲、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、Negativicutes纲和放线菌纲相对丰度较高。梭杆菌纲在4组样品中的相对丰度均最高。在属水平上，拟杆菌属、粪杆菌属、大肠埃希菌-志贺氏菌、乳杆菌属、普雷沃氏菌属9和罕见小球菌属是患者的主要优势菌属。

2.3 多样性分析Alpha多样性指数用于反映微生物群落的丰度、均匀性及多样性。Observed species指数、Chao1指数、ACE指数和Simpson指数常用来估算物种总数和多样性，值越高代表物种越多、多样性越丰富。Shannon指数用于评价样本中物种构成的丰度和均匀性，值越大表示该环境的物种越丰富，各物种分配越均匀。结果显示，4组患者粪便菌群中的Observed species指数、Chao1指数、ACE指数和Simpson指数差异均无统计学意义（P＞0.05）。Shannon指数患者控制期有家族史组（1-2组）显著低于发作期有家族史组（1-1组），控制期无家族史组（2-2组）显著高于发作期无家族史组（2-1组），差异均有统计学意义（P＜0.05）；控制期有家族史组（1-2组）与控制期无家族史组（2-2组）差异无统计学意义（P＞0.05）；发作期有家族史组（1-1组）显著高于发作期无家族史组（2-1组），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 精神分裂症患者粪便菌群Alpha多样性指数

2.4 差异物种分析随机森林分析可用来寻找重要的生物标记物，结果发现，患者控制期与发作期相比，优势物种是放线菌门的丙酸杆菌目、类诺卡氏菌科、阿托波菌属、链霉菌属和类诺卡氏菌属，厚壁菌门的明串珠菌科、魏斯氏菌属和粪球菌属2；患者发作期优势物种是厚壁菌门毛螺菌科的CAG-56属。患者有家族史组的优势物种是拟杆菌门的F082菌科、拟普雷沃氏菌属和厚壁菌门的粪球菌属2；无家族史组的优势物种是变形菌门的琥珀酸弧菌科。提示4组肠道菌群结构和多样性存在差异，控制期组和有家族史组肠道菌群多样性更加丰富，肠道菌群结构更加稳定。见图2。

图2 随机森林分析

3 讨论

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于16SrRNA基因研究的高通量测序技术在微生物生态学中得到广泛应用。16SrRNA是构成原核生物核糖体小亚基组分，其基因序列中有10个保守区域和9个高变区域。物种间保守区域差异较小，高变区域因物种亲缘关系的不同具有一定的种属特异性，因而，选用16SrDNA发现不同物种的特征核酸序列，被广泛应用于微生物结构和多样性的研究。人们对肠道菌群的关注也逐渐走向肠道微生物群整体多样性、复杂性以及动态性的研究，进一步探讨肠道菌群变化与人类健康和疾病的相关性，如肠易激综合征、肥胖、高血压、阿尔茨海默病、抑郁症等〔4-7〕。由4组患者显著差异物种分布结果可知，精神分裂症患者的肠道微生物结构和多样性存在差异，患者病情控制对肠道菌群结构分布有影响，控制期组较发作期组显著差异物种更加复杂丰富，有益菌群结构和多样性增加，提示精神分裂症患者其病情控制与肠道菌群结构可能存在关联。精神分裂症患者发作期较控制期肠道菌群结构和数量发生改变，控制期肠道菌群结构得到改善，肠道有益菌群多样性增加。精神疾病家族史可能对精神分裂症患者肠道菌群结构分布有影响，有家族史组比无家族史组显著差异物种更加复杂丰富，肠道菌群结构和多样性增加，并且发作期有家族史组比无家族史组显著差异物种更丰富，有益菌群增加，控制期有家族史组比无家族史组显著差异物种丰富，但有益菌群不显著。提示精神分裂症患者无家族史组比有家族史组肠道菌群结构和数量可能更易改变，并且精神疾病家族史可能对精神分裂症患者发作期肠道菌群影响较大，而对精神分裂症患者控制期肠道菌群影响不大。有遗传学研究发现，有家族史的精神分裂症患者神经系统软体征更显著，神经系统的成熟和协调性受到明显的影响，学习、领悟以及语言表达出现障碍，记忆能力发生损害〔8-9〕。说明有家族史的精神分裂症患者神经心理功能损害更为严重，影响中枢神经系统。大脑通过神经-免疫-内分泌系统调控胃肠功能，影响肠道菌群的结构，导致肠道菌群发生变化〔10-11〕。提示精神分裂症患者无家族史组可能易受外因影响，其疾病发作期时肠道菌群数量、结构和多样性发生改变。而精神分裂症患者有家族史组肠道菌群结构可能本身就存在特征分布，不易受外因影响，其疾病发作期时有家族史组较无家族史组肠道菌群结构不易改变。控制期病情症状得到改善，肠道菌群结构逐渐得以改善，肠道菌群多样性增加，此时，精神疾病家族史对精神分裂症影响较小。目前，关于精神疾病家族史对精神分裂症患者肠道菌群影响的研究还比较缺乏，其对肠道菌群的具体影响作用还有待进一步研究。

本次研究发现，肠道菌群中有很多菌群参与机体代谢产生短链脂肪酸（SCFA），如患者控制期组的乳酸杆菌属、瘤胃梭菌属9、毛螺菌属、罕见小球菌属和患者有家族史组的普雷沃氏菌属2、瘤胃梭菌属等显著高于患者发作期组和无家族史组，它们可以促进肠道内短链脂肪酸的产生，保护肠道健康、加强胃肠道机能活动，降低代谢障碍和炎症反应等的发生〔12-13〕，从而缓解精神分裂症症状。

由于本研究的样本量相对少、纵向采样时间短，可能影响测序结果的稳定性；虽然患者发病期和控制期来自同一研究对象，采用自身对照，但是组间存在个体差异，可能影响结果；研究对象来自同一医院，短期内饮食相似，采用联合用药，但未排除发病前期饮食、个人饮食习惯和具体用药情况的差异。这提示在下一步的研究中应增加样本量，延长纵向队列观察时间，同时控制饮食、药物等因素对肠道菌群的影响，得出信度更高、更加全面的精神分裂症患者肠道菌群的变化图谱。另外，为了更好地确定精神分裂症患者肠道菌群的变化特征，应增加健康正常人组（无精神疾病家族遗传史组和有精神疾病家族遗传史组）样本的采集，进一步明确精神疾病家族史对肠道菌群的影响，为下一步人们根据菌群变化特征防治疾病，发展新的疾病防治思路提供可能。