适用于近红外荧光/核磁双模成像的GdF3∶Nd3+，Yb3+@NaGdF4 纳米材料

何 旭 吴亚楠 蒋越宁 刘景涛 向先兴 文成旭 李 旭 王凤和

(河北大学 物理科学与技术学院，河北 保定 071002)

1 引 言

荧光成像一般利用来自内源性或外源性荧光团的颜色编码发射光谱，通过光谱来获取器官和组织以及亚细胞结构的详细图像，以揭示生物学的内在特征[1-3]。该技术具有非侵入性和非电离性的优点。目前荧光成像被应用于许多领域，如临床前测试和临床诊断、精确成像引导下的肿瘤手术切除、以及疾病进展的分子水平监测[4-8]。但是，波长400～650 nm 的荧光在生物体内成像深度小于1 mm，并且在该波长范围内，生物组织自身荧光的干扰作用使得信号空间分辨率和信噪比降低，所获得的活体图像质量严重降低[9-10]。研究表明，在650～1 450 nm 波长范围内生物组织吸收达到最低水平，且在该范围内成像波长越长，组织成分的光散射和自体荧光就会越少。并且根据公式h＝λα(h为穿透深度；λ是波长；α的值在0.2～4 之间，取决于组织的组成成分)可知，荧光成像波长越长，有效的成像深度越大[11]。相较于传统的可见光和近红外第一窗口(NIR-Ⅰ，700～900 nm)荧光成像，第二近红外窗口(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)的荧光成像因其前所未有的组织穿透性和空间分辨率而受到了极大关注，此外，它还具有最小的光子吸收和散射以及可以忽略的组织自荧光效应[12-14]。所以开发近红外荧光纳米级探针具有十分重要的意义。

作为NIR-Ⅱ荧光成像的优秀候选材料，镧系元素掺杂的下转移纳米颗粒具有优异的光学性质，如尖锐的发射带、大的斯托克斯位移、无光漂白性以及较长的荧光寿命[15-16]。Yb3＋具有单一激发态(2F5/2)，它产生的发射中心在1 000 nm 附近，通常具有数百微秒的发射寿命，比自发荧光寿命高出几个数量级[17]。因此，含有Yb3＋的纳米晶体在近红外时间门控光学成像领域具有很大吸引力。然而，Yb3＋需要使用980 nm 的激光作为激发光源，生物物种过度暴露在980 nm 的光下会导致组织过热问题，从而导致显著的细胞死亡和组织损伤。解决这一问题可以通过共掺杂Nd3＋将激发波长峰值从980 nm 调控至800 nm 附近。因为Nd3＋具有以800 nm 为中心的锐利吸收带，而且生物组织中的水分子在800 nm 处的吸收系数比在980 nm 处的吸收系数要低10 倍左右，可以有效避免激发光源引起的生物组织过热问题[18]。Nd3＋的4F3/2能级与Yb3＋的2F5/2能级接近，Nd3＋和Yb3＋共掺杂体系在808 nm 激发下，Nd3＋既作为Yb3＋的敏化剂，同时又作为发光中心，实现了同时具备Nd3＋和Yb3＋两个发光中心的双发光中心近红外发光，既避免了980 nm 激发的组织过热问题，同时又提高了近红外发光的性能。

Gd3＋具有7 个未成对电子，可以有效地诱导水质子的纵向弛豫。含有Gd3＋的化合物一般具有顺磁性，可以作为磁共振成像(MRI) 造影剂[19]。GdF3和NaGdF4材料具有光学惰性，是很好的稀土掺杂基质材料。因此，稀土掺杂使得Gd3＋的氟化物同时具备了荧光成像和MRI 成像的双模成像性能。双模成像模型可以有效增加病灶诊断的准确性，为诊断和治疗提供有力依据。

本文采用GdF3为基质，利用Nd3＋和Yb3＋共掺杂体系，实现了808 nm 激发下的双发光中心近红外发光。采用热分解方法合成GdF3纳米材料，并讨论了合成参数对产物形貌的影响，研究了离子掺杂浓度对纳米GdF3∶Nd3＋，Yb3＋发光性能的影响。通过异质壳层NaGdF4的包覆形成具有核壳结构的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4，研究了惰性层对纳米材料GdF3∶Nd3＋，Yb3＋发光性能的影响，研究了GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4材料的近红外发光性能和磁性能。

2 实 验

2.1 实验药品

实验原料包括:稀土氧化物(Gd2O3、Nd2O3、Yb2O3)、三氟乙酸锂(CF3COOLi)、三氟乙酸(CF3COOH)、氯化钆(GdCl3·6H2O)、十八烯(ODE)、油酸(OA)、氢氧化钠(NaOH)、氟化铵(NH4F)、环己烷、无水乙醇、甲醇、丙酮均为分析纯(AR)，阿拉丁化学试剂有限公司；高纯氩气(99.999%)，保定京联气体有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 GdF3和GdF3∶Nd3＋，Yb3＋合成

以相应的镧系氧化物和三氟乙酸为原料，合成相应的稀土三氟乙酸化合物RE(CF3COO)3(RE＝Gd，Nd，Yb)[20-21]。所有纳米颗粒都在高沸点极性溶液中以热分解的方法合成[22]。分别将1 mmol 的RE-(CF3COO)3和1.5 mmol 的CF3COOLi 加入12 mL OA 和12 mL ODE 的混合物中，在室温下将其置于四颈烧瓶中，搅拌并通氩气持续30 min。在氩气保护氛围中将以上溶液加热到120 ℃，并搅拌去除水蒸气。以30 ℃/min 的升温速率，将溶液快速加热至280 ℃，并在氩气气氛中保持特定的反应时间。溶液冷却至室温后，加入过量的丙酮沉淀纳米颗粒，用乙醇和环己烷洗涤三次，离心收集。最终产物分散在环己烷中。

2.2.2 GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4合成

采用热注入法包裹惰性壳NaGdF4[23]。将6 mL OA、15 mL ODE 和一定量的GdCl3·6H2O 室温下置于四颈烧瓶中，搅拌并通氩气持续30 min。然后在氩气保护氛围中将溶液加热到120 ℃，保持30 min 至溶液澄清透明，除去水蒸气后降温。缓慢滴入NaOH 和NH4F 的甲醇溶液，升温到70℃，搅拌30 min 去除甲醇。再把GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒加入到上述溶液中，加热到80 ℃，搅拌半小时去除环己烷。通60 min 氩气后将上述溶液加热到300 ℃保持1 h，然后降温冷却。用乙醇和环己烷溶液对合成产物进行洗涤，最终产物分散于环己烷中。根据制备核与壳的反应物中Gd3＋的量比值，将合成的不同惰性壳厚度的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4材料分别标记为核壳比1∶0.5，1∶1和1∶2。通过双亲性聚合物PBMA-g-C12对GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4进行表面改性[24]，制备的亲水性材料标记为GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12。

2.3 样品表征

样品衍射数据表征使用X 射线衍射仪(XRD 6000 Shimadzu)，扫描速度为8(°)/min。样品的形貌由透射电子显微镜(TEM，JEOL 2100 plus)进行表征。光致发光的发射光谱采用Acton-2750光谱仪和液氮冷却普林斯顿PyLon 100BR-eXcelon 阵列CCD 探测器测定，激发光源为808 nm 激光器。样品近红外照片中的“HBU”图案采用激光打标机(亚聚激光，YJ-001)在黑色PE 板刻蚀得到。MRI 弛豫时间和T1加权成像照片通过核磁共振扫描仪(BioSpec 94/20 US)在9.4 T 磁场下进行测试。所有测试均在室温下完成。

3 结果与讨论

3.1 合成参数对形貌的影响

实验过程中，材料合成参数会对合成产物的形貌产生明显的影响，在本实验中我们讨论了反应时间和前躯体浓度对GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒形貌的影响。材料合成时的反应时间是影响材料形貌的一个主要因素。一般来说，较长的反应时间往往会产生较大的纳米颗粒。为了研究反应时间对GdF3∶Nd3＋，Yb3＋形貌的影响，我们固定前驱物中的药品浓度，调节反应时间长短。图1为不同反应时间下合成的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒的TEM 形貌。从图中可以看出，当反应时间为15 min 时，得到的纳米颗粒为细长棒状结构，粒径约为45 nm。随着反应时间逐渐增加至60 min，纳米颗粒的长度未发生明显变化，宽度逐渐增加，逐渐开始显示出六边形的形貌。继续增加反应时间，GdF3∶Nd3＋，Yb3＋的粒子形状没有明显变化，尺寸开始明显增大，由45 nm 增加至100 nm。当我们固定反应时间为60 min，调节前驱物的浓度也可以有效地调控纳米颗粒形貌。将RE-(CF3COO)3和前驱体CF3COOLi 的比例分别调节为1∶1.5 和1∶0.5，前驱物浓度降低时，制备的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒明显变小。如图2(a)所示，当前驱物浓度降低到1∶0.5 时，合成的纳米颗粒尺寸为(6.6 ±1.2) nm。

图1 不同反应时间合成的GdF3 的TEM 形貌。(a)15 min；(b)30 min；(c)60 min；(d)90 min。Fig.1 TEM morphology of GdF3 synthesized at different reaction time.(a)15 min.(b)30 min.(c)60 min.(d)90 min.

由于GdF3∶Nd3＋，Yb3＋颗粒的尺寸非常小，所以掺杂的稀土元素很多都位于纳米颗粒的表面。纳米颗粒表面存在大量的缺陷，容易引起发光猝灭现象。为了有效地避免这一现象发生，我们引入具有光学惰性的NaGdF4作为保护层生长在GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒上，形成核壳结构。图2(b)～(d)分别展示了核壳比为1∶0.5，1∶1和1∶2的不同惰性壳厚度的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4核壳纳米颗粒的形貌，NaGdF4包覆后能明显地观察到纳米颗粒尺寸增加，尺寸分别为(8.9 ±1.8)，(10.2±1.1)，(13.6 ±1.9) nm，壳层厚度分别为(2.3 ±0.6)，(3.6 ±0.1)，(7.0 ±0.7) nm。

图2 不同核壳比GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠ NaGdF4 的TEM 形貌图。(a)1∶0；(b)1∶0.5；(c)1∶1；(d)1∶2。Fig.2 TEM morphology of GdF3∶3% Nd3＋，5% Yb3＋＠NaGdF4 with different core∶shell ratio.(a)1∶0.(b)1∶0.5.(c)1∶1.(d)1∶2.

3.2 GdF3∶Nd3+，Yb3+@NaGdF4 的X 射线衍射(XRD)图谱和发光机理

本实验后续表征均选用(6.6 ±1.2) nm 的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒为研究对象。实验制备的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒的衍射峰与标准六方相GdF3的衍射数据相比，基本吻合(图3)。这表明合成的GdF3纳米颗粒为六方相，稀土元素的掺杂并未改变GdF3的晶体结构。包覆NaGdF4惰性壳后的纳米颗粒的XRD 与NaGdF4六方相的标准卡片(JCPDS No.27-0699)吻合，证明NaGdF4壳层成功外延生长在GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒的表面。

图3 GdF3∶3%Nd3＋，x%Yb3＋(x ＝0，5)和GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4(核壳比1∶0.5，1∶1，1∶2)的X 射线衍射谱Fig.3 XRD patterns of GdF3∶3%Nd3＋，x%Yb3＋(x ＝0，5) and GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠ NaGdF4(core∶shell ratio 1∶0.5，1∶1，1∶2)

图4 为Nd3＋和Yb3＋的能级图。在808 nm激光激发下，Nd3＋捕获激发光的能量后，其处于4I9/2基态的电子被激发到4F5/2能级，而后处于4F5/2激发态的电子非辐射弛豫至4F3/2能级，最后处于4F3/2激发态的电子分别辐射跃迁至4I11/2和4I13/2能级而发射出1 064 nm 和1 340 nm 的近红外二区荧光。Nd3＋的4F3/2能级的能量可通过4F3/2(Nd3＋) ＋2F7/2(Yb3＋)→4I9/2(Nd3＋) ＋2F5/2(Yb3＋)的能量传递过程将其传递给Yb3＋，从而实现Yb3＋的2F5/2能级的980 nm 发光(2F7/2→2F5/2)[25-27]。因此，本文选用Nd3＋和Yb3＋共掺杂体系实现了808 nm 激发下的近红外发光。晶体材料中Yb3＋的掺入通常允许有数百微秒的发射寿命，比自发荧光寿命高出几个数量级[17]，所以用Nd3＋和Yb3＋共掺的双发光中心纳米颗粒更适合做近红外生物成像探针。

图4 在808 nm 激发下，掺杂Nd3＋和Yb3＋下转移机制能级图。Fig.4 Energy level diagram of Nd3＋and Yb3＋down-shifting mechanism under 808 nm excitation

3.3 近红外发射光谱

实验首先探究了掺杂不同浓度Nd3＋的纳米颗粒的近红外发光性能(图5)。在808 nm 激光激发下，单掺Nd3＋的GdF3发射光谱呈现出位于1 064 nm 和1 340 nm 的两个发射峰，这两个发射峰分别归因于Nd3＋的4F3/2→4I11/2和4F3/2→4I13/2电子跃迁[28-29]。Nd3＋掺杂浓度从1%提升到3%的过程中发射峰强度逐渐增强，当掺杂浓度超过3%时，发射峰强度减弱。这是由于浓度猝灭效应引起的，4F3/2＋4I9/2→24I15/2的交叉弛豫可以通过非辐射跃迁使4F3/2的能级布居数减少[30]。随着Nd3＋浓度的增加，由于Nd3＋-Nd3＋距离变近，这种非辐射交叉弛豫过程会增强，导致近红外发光减弱[31]。

图5 808 nm 激发下GdF3∶x%Nd3＋(x ＝1，2，3，5，7)的近红外发射光谱Fig.5 NIR spectra of GdF3∶x%Nd3＋(x ＝1，2，3，5，7) nanoparticles under 808 nm excitation

为了研究GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米颗粒的近红外光学性质，在808 nm 激光的激发下，对制备的材料进行了室温下发射光谱测试，测试结果根据材料在808 nm 的吸光度做归一化处理。如图6 所示，Nd3＋掺杂浓度固定为3%，改变Yb3＋掺杂浓度可以显著改变发射光谱。随着Yb3＋浓度从1% 增加到5%，Yb3＋粒子的980 nm 发射强度显著增加。这表明在GdF3∶Nd3＋，Yb3＋体系中，存在明显的Nd3＋到Yb3＋能量传递现象。随着Yb3＋含量的进一步增加，Yb3＋的980 nm 发射强度逐渐降低。实验结果表明，Yb3＋的掺杂浓度为5%时与Nd3＋之间具有较高的能量传递，高掺杂水平下发射强度的降低可能是由于浓度猝灭效应[24，30]。

图6 808 nm 激发下GdF3∶3%Nd3＋，x%Yb3＋(x ＝1，2，3，5，7)的近红外发射光谱Fig.6 NIR spectra of GdF3∶3%Nd3＋，x%Yb3＋(x ＝1，2，3，5，7) nanoparticles under 808 nm excitation

小尺寸纳米颗粒常常由于其较大的比表面积存在较多的表面缺陷，从而引起明显的光猝灭现象，通常采用包覆惰性壳的方式来钝化这些缺陷，以减少因表面缺陷造成的能量损失。有报道表明，相比于同质核壳结构，异质核壳结构更有利于提高纳米材料的发光强度[32]。实验结果表明，包覆NaGdF4壳层的厚度对GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4核/壳纳米晶体的发光强度有明显的影响(图7)。在NaGdF4壳层的外延生长过程中，GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米晶的表面缺陷逐渐钝化，有利于改善因表面缺陷引起的光猝灭现象。

图7 展示了具有不同厚度惰性壳的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4纳米颗粒发射光谱。通过改变制备阶段核与壳的前驱物比例来调控NaGdF4壳层厚度。我们以合成核和壳的前驱物中Gd3＋的量比值为准，分别合成了惰性壳厚度为(2.3±0.6)，(3.6 ±0.1)，(7.0 ±0.7) nm 的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4样品。通过对比发现，生长惰性层后样品的发光强度有显著的提升。当惰性壳厚度为(3.6 ±0.1) nm 时，样品的发光强度是未生长惰性层样品发光强度的2.43 倍。继续生长惰性壳厚度，样品发射强度开始下降，是由于惰性壳厚度过厚导致激发光和发射光透过惰性层后强度发生衰减。

图7 808 nm 激发下不同厚度NaGdF4 惰性壳GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4 的近红外发射光谱Fig.7 NIR emission spectra of GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4 nanoparticles with different NaGdF4 shell thickness under 808 nm excitation

3.4 近红外成像和磁性性能

热分解法合成的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4纳米颗粒具有疏水性，为了适应生物领域的应用环境，我们选择双亲性聚合物PBMA-g-C12对其进行表面改性，成功地将GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4纳米颗粒转入水相。如图8(a)所示，GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4纳米颗粒被成功地包裹到聚合物PBMA-g-C12之中，形成大小约100 nm 的纳米球，标记为GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4＠ PBMA-g-C12。MRI 成像性能使用核磁共振扫描仪在9.4 T 磁场下进行测试。以纯水为对照，我们测试了不同Gd3＋浓度的GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4＠ PBMA-g-C12水溶液的T1弛豫时间。并且通过T1弛豫时间和Gd3＋的浓度计算得到GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠ PBMA-g-C12的磁共振纵向弛豫率r1为5.10 L·mmol－1·s－1。图8(c)显示了GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12的MRI 的T1加权图像。从图中可以看出，与纯水对比，GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4＠ PBMA-g-C12溶液在较低的Gd3＋浓度下即可明显提高MRI 成像对比度。

图8 GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12的TEM 形貌(a)、T1 磁性弛豫率(b)、T1 加权成像照片(c)；GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4 纳米颗粒的自然光照片(d)和808 nm 激光下的照片(e)；GdF3∶3%Nd3＋，5%Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12水溶液在自然光下的照片(f)和808 nm 激光下的照片(g)。Fig.8 TEM(a)，T1 magnetic relaxivity property(b) and T1-weighted image(c) of GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12 nanoparticles.Pictures of GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠PBMA-g-C12 nanoparticles taken under sunlight(d) and 808 nm laser irradiation(e).Pictures of nanoparticles water solution taken under sunlight(f) and 808 nm laser irradiation(g).

如图8(e)，在暗室中，通过扩束镜对808 nm激光扩束后激发材料，采用近红外相机拍摄得到近红外照片，上下两部分分别为空白“HBU”和填充样品后的“HBU”(可参照图8(d)自然光下拍摄的照片)，可以看到GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4样品具有良好的近红外发光性能。图8(f)、(g)分别为GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4＠PBMAg-C12水溶液在自然光下的照片和808 nm 激光激发下的近红外成像照片。由图中可以看出，通过聚合物将纳米颗粒转移到水相后，纳米颗粒仍具备较好的近红外发光性能。

以上结果表明GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠ NaGdF4纳米材料同时具备NIR 荧光成像性能和MRI 成像性能，可以作为双模的荧光探针和MRI 造影剂使用，有利于避免单模成像自身局限性。

4 结 论

本文合成了Nd3＋和Yb3＋掺杂的GdF3纳米颗粒，并通过合成参数调控纳米材料的形貌。XRD 数据表明该纳米材料为六方相，稀土离子的掺杂未使得晶相发生改变。在808 nm 激发下，GdF3∶Nd3＋，Yb3＋纳米材料显示出近红外发射，发射峰分别位于980，1 064，1 340 nm。在GdF3∶Nd3＋，Yb3＋中存在明显的Nd3＋到Yb3＋的能量传递。其中Nd3＋的最佳掺杂浓度为3%，Yb3＋的最佳掺杂浓度为5%。高浓度掺杂会造成发光强度降低，主要是因为浓度猝灭效应。在GdF3∶Nd3＋，Yb3＋表面外延生长NaGdF4惰性壳能够有效增强纳米颗粒的发光强度，当壳层厚度为(3.6 ±0.1) nm 时，纳米颗粒的发光强度增强到原来的2.43 倍。GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4具有良好的顺磁性，适合作为MRI 成像造影剂。本文通过Nd3＋对Yb3＋的能量传递，实现了808 nm激发下Nd3＋和Yb3＋的近红外发光，避免了传统980 nm 激发对生物体产生的过热损伤。GdF3∶Nd3＋，Yb3＋＠NaGdF4纳米材料显示了出色的近红外发光性能和顺磁性能，通过双亲性聚合物PBMA-g-C12将其转入水相，在生物荧光成像和MRI 成像中具有良好的应用前景。

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