一株高地芽孢杆菌的鉴定与促生能力研究

张文韬 杨皓 毛国豪 庄家尧 陈新峰

摘要：从野生大豆根瘤内分离出菌株Y1并对其进行分子生物学鉴定，观察其特性以及对大豆的促生作用。16S rDNA鉴定表明，菌株Y1为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）;采用Salkowski法验证该菌株产生长素（IAA）的能力，发现其产IAA的量为38.49 mg/L。同时该内生菌具有解有机磷和无机磷的能力，溶磷量分别为71.48、152.36 mg/L。将菌剂接种到大豆幼苗后观察其促生能力，结果显示，接种该菌株可显著增加大豆的株高和根长，同时，大豆叶片光合参数也有所提升。该结果可为研发新型微生物肥料提供优质菌种，为进一步研究芽孢杆菌属促生潜力提供理论依据。

关键词：高地芽孢杆菌;16S rDNA;鉴定;促生潜力

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）05-0225-04

收稿日期：2021-09-29

基金項目：国家重点研发计划（编号：2017YFC0505500）;江苏省教育厅资助项目（编号：2019JSJG247）;江苏省高等学校林学优势学科建设项目（编号：164010641）。

作者简介：张文韬（1998—），女，山东济南人，硕士研究生，研究方向为水土保持与荒漠化防治。E-mail：szdl123456@sina.cn。

通信作者：庄家尧，博士，副教授，研究方向为水土保持与荒漠化防治。 E-mail： nlzjiayao@njfu.edu.cn。

近代以来人口急剧增加，随之而来的粮食短缺这一问题日益严峻，而粮食作物生长过程中农药化肥的使用不可避免。同时，农药化肥过度使用也带来了环境污染、土壤板结盐渍化等许多问题。近年来，微生物菌肥因其高效、绿色的特点走入了大众视线。微生物菌肥是以微生物的生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品[1]，通过微生物自身分解作用，可以起到增加土壤肥力、供给植物养分等作用。相较于传统化肥，微生物菌肥有以下明显优势：（1）促进植物生长，提高产量品质。可以通过促进营养获取或改变植物激素水平来直接促进生长，也可以通过减少各种病原体对植物生长的抑制作用来间接促进生长发育，根瘤菌、巨大芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌等是非常常见的植物生长促进细菌，有助于大幅提高作物产量和整个植物的生长[2]。（2）减少连作障碍，防范病虫害。微生物菌肥能够对土壤中的病原菌分泌物进行分解和抑制，来帮助土壤中有益微生物进行繁殖[3]，起到生物防治的效果。（3）改良土壤，增加土壤肥力。施用微生物菌肥可以增加土壤中的有益菌数量，提高土壤的保水保温能力。同时部分菌肥可以起到固氮作用，一些微生物可以活化土壤里磷钾矿物，帮助植物溶解磷钾元素，从而增加土壤肥力[4]。

在我国已经登记在册的有7 608种微生物菌肥商品，应用最广泛的为链霉菌属（Streptomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus） 和乳酸杆菌属（Lacto bacillus） 的菌种，其中又以芽孢杆菌属应用率最高。李铭东等研究了多黏类芽孢杆菌菌剂对于玉米生长的影响，发现在施用多黏类芽孢杆菌菌剂和正常化学肥料混合的处理比单独施用正常化学肥料的处理，玉米的出苗率和苗高更高，同时发现使用菌剂的处理比没有添加菌剂的处理根腐病发病率更低，玉米的产量更高[5]。高加明等从土壤中分离筛选1种高效解钾菌菌株NGW1并应用于烟草栽培，发现添加菌种的植株其有效叶数、株高、最大叶宽、茎围指标均高于对照组[6]。钟松等通过在土壤施加胶质芽孢杆菌菌肥，发现该菌肥可有效提升高寒草原土速效养分，促进高寒草原牧草的根系生长[7]。

试验菌株Y1是笔者所在课题组前期从野生大豆（Glycine soja）瘤内分离纯化得到的。首先对其进行16S rDNA测序鉴定其菌种，分析该菌种的生物学地位。随后分别对其产生长素能力、溶磷能力指标进行测定，最后将其接种到大豆植株上观察其促生效应，以期发掘优良的植物促生菌种资源，为芽孢杆菌菌肥的开发和广泛利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养材料

酵母甘露醇琼脂（YMA）培养基：甘露醇10 g、七水硫酸镁 0.2 g、氯化钠0.1 g、酵母粉3 g、磷酸氢二钾0.25 g、磷酸二氢钾 0.25 g、碳酸钙3 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值7.0（液体培养基内不放琼脂）。

Salkowski比色液：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶解于49 mL 35%浓H2SO4。

无机磷培养基：葡萄糖10 g、硫酸铵0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化钠0.3 g、氯化钾0.3 g、硫酸镁0.3 g、硫酸亚铁0.03 g、硫酸锰0.03 g;磷酸钙5 g、琼脂 15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值7.0。

有机磷培养基：葡萄糖10 g、硫酸铵0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化钠0.3 g、氯化钾0.3 g、硫酸镁0.3 g、硫酸亚铁0.03 g、硫酸锰0.03 g、卵磷脂0.2 g、碳酸钙1 g、琼脂15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 菌种16S rDNA序列鉴定

提取Y1的DNA后，进行16S DNA的扩增，将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0纯化试剂盒对产物进行纯化。将纯化后产物送至广州基迪奥生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI数据库上进行比对，获知与该细菌的16S DNA序列同源性最高的已知序列。细菌测序所用的引物为通用引物515F/907R，引物序列515F ：5′-GTGCCAGCMGCCGCCG-3′; 907R ：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。

1.3 供试菌株分泌生长素（IAA）测定

在灭菌的YMA液体培养液中加入200 mg/L的L-色氨酸，接种Y1菌株后置于28 ℃、160 r/min恒温振荡培养箱中，7 d后，取50 μL菌悬液滴于白色塑料比色板上，同时加50 μL Salkowski比色液。将白色陶瓷板放在室温下避光30 min，若颜色变红表示Y1具有分泌生长素的能力[8]。菌株Y1产生IAA的浓度参考刘玉珍等的计算方法[9]。本试验进行3次生物学重复。

1.4 供试菌株溶磷能力测定

1.4.1 定性测定 将制备的单一菌株活化后，用牙签点至无机磷和有机磷培养基平板中，置于28 ℃恒温培养箱中7 d，在平板中菌落周围出现透明圈的即为解磷菌。

1.4.2 定量测定 将菌株Y1接种于新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养1 d制成菌液，取1 mL加入无机磷液体培养基中，用钼锑抗比色法来测定上清液中有效磷含量。具体步骤参照文献[10]。

1.5 大豆促生试验

试验于2021年4月在南京林业大学林学院简易大棚内进行。大豆促生试验参照舒健虹等的方法[11]，并作修改：将花土 ∶蛭石按体积比 3 ∶1 混合灭菌后放入花盆中，每个花盆放6 L混合土。把发芽程度相似的大豆种子播于盆中，放置在气候箱内，在长出第1张真叶时，每株植物根部各接种 1 mL 菌悬液，以接种1 mL灭菌培养液为对照。每 3 d 喷洒1次营养液保持湿润。45 d后，测其地上部分与地下部分生长情况。并使用LI-6400便携式光合仪（Li-Cor Inc.USA）测定大豆叶片的光合数据。

1.6 数据处理

采用Excel 2016进行数据统计和计算，利用SPSS 26.0进行显著性差异分析，使用Origin 2018软件制图。利用生物信息平台提供软件MEGA 6.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 Y1的分子鉴定

Y1的16S区序列在GenBank对比后发现该菌株为Bacillus altitudinis（高地芽孢杆菌），将菌株Y1的16S rDNA测序结果进行同源性比较后利用MEGA 6.0构建系统发育树，发现其与Bacillus pumilus（AY456263）的同源性最近（图1）。

2.2 Y1分泌植物生长素能力鉴定

由图2可知，室温避光30 min后，白色瓷板上的液体明显变成粉红色，说明菌株Y1具有产生长素能力。用3-吲哚乙酸制作标准曲线为y=0.046 978x（r2=0.99），经计算，菌株Y1产IAA量为38.49 mg/L。

2.3 Y1解磷能力

2.3.1 定性测定 由图3可知，Y1在无机磷和有机磷培养基上均有明显透明溶磷圈出现。

2.3.2 定量测定 由图4可知，菌株Y1在无机磷和有机磷液体培养基中的溶磷量随时间变化呈增加趋势，且溶解无机磷的能力高于溶解有机磷。7 d时，菌株Y1无机磷和有机磷中的溶磷量分别为152.36、71.48 mg/L。

2.4 接种菌株Y1对大豆叶片光合作用的影响

由表1可见，加菌组净光合速率与对照相比显著增加136.73%，气孔导度与对照组相比显著增加120.69%，胞间CO2浓度比对照组显著提升28.95%，蒸腾速率与对照组相比显著增加168.57%，达0.94 mmol/（m2·s），水分利用效率相比对照增加不显著。

2.5 接种菌株Y1对大豆植株生长指标的影响

由表2可见，接种Y1菌株45 d后，株高显著增加23.82%，根长显著增加26.98%，地上部分鲜质量、地上部分干质量、茎粗均有所增加但并不显著。这可能是由于植株之间这类指标的差异本身就小，所以无显著变化。

3 讨论与结论

吲哚乙酸（IAA）是植物存活过程中不可缺少的生长调节物质，植物根部对IAA非常敏感，多數植物内生菌都有产IAA的能力[12]。陈迪等从槟榔根际土壤和槟榔叶柄中分离细菌，测量它们对槟榔盆栽苗的促生能力，得到了有明显促生作用的菌株 DC-7，测得吲哚乙酸（IAA）含量为35.78 mg/L，说明菌株DC-7的促生长作用可能来源于它的产IAA能力[13]。姜云等从人参中分离出菌株苏云金芽孢杆菌JJ5-2的产IAA能力为10.2 mg/L[14]。本试验中，菌株Y1的产IAA量为38.49 mg/L，说明该菌株有较高的产IAA能力。

土壤库中存在着大量磷素，但能够直接被植物吸收利用的可溶性磷的含量很低，为实现环境友好型的可持续发展战略目标，应在增加作物产量的基础上减少化学肥料的使用。溶磷菌可以促进土壤中有效磷的释放，提供植物生长发育所必需的磷元素，促进植物的生长发育[15]。芽孢杆菌属是目前报道的溶磷能力较强的菌种之一[16]。Hameeda等将筛选得到的5株解磷菌进行了盆栽和大田试验，结果均表明接菌后能够促进玉米的生长[17]。宋娟等从枫香根际土壤中筛选出4株解磷菌，并将其接种于枫香幼苗，发现该菌能够显著提高枫香的株高和地径[18]。本试验发现菌株Y1在无机磷和有机磷培养基板可以产生透明溶磷圈，具有解磷能力。同时，该菌株在无机磷和有机磷培养基中的溶磷量分别为152.36、71.48 mg/L。韦宜慧等从杉木林中筛选出溶磷能力最强的3株菌株，其溶解无机磷量分别为195.61、109.20、78.86 mg/L[19]。Irawan等从油棕（Elaeis quineensis）根际土壤筛选出的溶磷菌溶解无机磷量为58.6 mg/L[20]。说明Y1菌株的溶磷能力在溶解无机磷能力中属于偏上水平，且兼具溶解有机磷的能力，是一株可以用作微生物肥料的菌株。

光合作用是植物生长发育最基本的生理活动之一，能够为自身提供所需要的物质和能量[21]。其中净光合速率是指植物通过叶绿素吸收固定光能辐射，在光合作用过程中积累有机物质，通常用于表征植物的光合效率。蒸腾速率能够反映植物体内矿物质和水分运输的强弱以及叶片在强光下降温的效果。气孔导度通常表现为植物叶片细胞的开合程度，在很大程度上决定了植物对二氧化碳的吸收作用、植被的光合效率以及呼吸速率。水分利用效率能够反映植物在生长过程中的能量转化效率[22]。本试验中大豆接种菌株Y1后光合参数提升，能够提升大豆对光的利用效率，从而促进光合作用。

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