孕中期羊水游离RNA中泌尿系统发育关键基因的筛选与生物学功能分析

杨树法，刘妍，王天铎，秦朗，闫有圣，阴赪宏

首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院产前诊断中心，北京100026

先天性肾脏疾病严重影响患儿生活质量，预防先天性肾病能够有效降低社会和家庭的负担。现代分子生物学技术的临床应用使得更多类型的染色体微缺失/重复、点突变等基因组变异被检出，提高了先天性肾病发育相关基因突变的检出率。与成人遗传咨询相比，产前阶段胎儿临床资料相对缺失，使得正确阐释这些基因组变异的临床意义面临挑战。研究表明，与胎儿发育相关的基因信息存在于羊水游离RNA（AfcfRNA）中［1-3］，分析AfcfRNA 中基因变化有助于解读基因突变的致病性。但是，AfcfRNA 中基因来源组织的多样性和泌尿系统发育的复杂性，增加了从AfcfRNA 中获取泌尿系统发育信息的难度。因此，2020 年1 月—2021 年1 月，本研究分析了孕中期正常胎儿AfcfRNA 转录组，试图从AfcfRNA转录组中筛选泌尿系统发育相关的关键基因，为AfcfRNA 在产前胎儿泌尿系统发育评估中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 芯片数据来源 从GEO 数据库中按照入选和排除标准下载胎儿AfcfRNA 的芯片检测数据。共获取56 例 胎 儿AfcfRNA 的 检 测 结 果（GSE101141，GSE16176， GSE25634， GSE33168， GSE47394，GSE48521，GSE49893，GSE58435），芯 片 类 型 为Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0芯片。56例标本均为孕中期（孕13～27 周）羊水，孕妇无妊娠并发症，单胎妊娠，胎儿发育正常，染色体核型正常。排除胎儿B超检查结果异常者。

1.2 基因共表达网络分析 采用Olgio软件对芯片检测结果进行读取、背景校正以及归一化。在获取基因表达量后，利用SVA 软件包去除批次效应，使不同芯片检测结果具有相似的均值和标准差。在不同样品的检测结果具有可比性的基础上，利用WGCNA 软件的动态树形剪切算法建立基因共表达模块，进行基因共表达网络分析，软阈值设为12，最小类的大小设置为30。筛选得到的基因共表达模块以不同颜色名称表示。通过分析AfcfRNA 转录组中基因平均表达量和变异系数（CV%），显示不同模块基因表达量情况。CV 值为基因在所有研究样品的表达量的标准差除均值再乘100得出。

1.3 泌尿组织特异基因筛选 从Human Protein Atlas 数据库［4］下载正常组织的基因表达量数据（https：//www.proteinatlas.org/download/rna_tissue_consensus.tsv.zip）。编写R 语言脚本，统计分析数据所涉及组织和基因类别。将在泌尿组织中的表达量高于所有组织中平均表达量10 倍以上的基因判定为泌尿组织特异基因。

1.4 泌尿组织特异基因共表达模块的功能富集分析 编写R 脚本，从共表达模块中选取泌尿组织特异基因，建立泌尿组织特异基因共表达模块。利用Cluster Profiler 软件包对每个泌尿组织特异基因共表达模块中的基因进行GO 功能富集分析［5］。用Benjamini-Hochberg 法进行P值调整，校正P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 共表达基因的蛋白—蛋白相互作用（PPI）网络分析及关键基因筛选 从STRING数据库下载PPI数据（https：//stringdb-static.org/download/protein.links.v11.0/9606.protein.links.v11.0.txt.gz）［6］，Igraph软件包进行PPI网络制图，编写R语言脚本，统计泌尿组织特异基因共表达模块中基因编码蛋白的相互作用关系，将combine_score 设为150，统计每个基因的degree，选择degree＞20的基因作为关键基因。

2 结果

2.1 正常AfcfRNA 中基因共表达模块 利用WGCNA 软件共建立20 个共表达模块，以不同的颜色表示模块名称（black，blue，brown，cyan，green，greenyellow，grey60，lightcyan，lightgreen，lightyellow，magenta，midnightblue，pink，purple，red，royalblue，salmon，tan，turquoise 及yellow）。具有共表达关系的基因具有更高的表达量。

2.2 泌尿组织特异基因共表达模块的功能富集分析结果 Human Protein Atlas 数据库中泌尿组织包括肾脏和膀胱。筛选出270 个基因为泌尿组织特异基因。分别将这270 个泌尿组织特异基因与共表达模块中的基因取交集，建立泌尿组织特异基因的共表达模块。在brown，green 及turquoise 模块中富集到泌尿系统功能相关的GO 分析项目（表1）。这些功能涉及中肾发生和发育、肾单位发生、肾小球、肾小管生成及肾上皮发育等肾脏发育相关功能。

表1 泌尿组织特异基因共表达模块的功能富集分析结果

2.3 泌尿组织特异基因共表达模块中关键基因筛选结果 将brown、green 及turquoise 模块内的泌尿组织特异基因进行PPI 网络分析，确定各个模块的关键基因。在combine_score 为150、degree 为20 时，共筛选到18 个关键基因，分别为CLCNKB、MIOX、NAT8、SLC13A3、SLC3A1、SLC6A18、UGT1A6、REN、AQP2、BSND、CYP24A1、CYP4A11、FOXI1、FXYD2、SLC17A1、SLC34A1、SLC7A9 及TRPV5。计算各基因在所有样品中的平均表达量，得到P25为3.09，利用该阈值将孕中期AfcfRNA 中表达量偏低的关键基因删除，得到孕中期高表达的13个关键基因，其中5个基因来自brown 模块（CLCNKB、SLC6A18、NAT8、MIOX 及SLC3A1）、8 个 基 因 来 自turquoise 模 块（AQP2、CYP4A11、SLC7A9、SLC13A3、FXYD2、TRPV5、SLC17A1 及BSND）。各关键基因的来源模块、degree、平均表达量及CV%见表2。

表2 18个泌尿系统发育关键基因分析结果

3 讨论

泌尿系统主要由肾脏、膀胱和尿道组成。B 超是筛查肾脏先天畸形的主要手段，但对于肾小球、肾小管等微小结构病变及肾泌尿和排泄功能的异常，产前B超筛查难以检出。获取与肾脏发育密切相关的分子标志物具有重要临床意义。

AfcfRNA 来源于孕妇羊水，是可安全获取的胎儿组分。本研究利用WGCNA 分析将AfcfRNA 中的基因归为20 个共表达模块。在共表达关系建立过程中，部分低表达量基因被过滤。AfcfRNA 来源于胎儿多个组织，针对此特点，研究中利用基因表达数据库，筛选了泌尿组织特异基因，将其与共表达模块相结合，建立了泌尿组织特异基因共表达模块。通过GO 分析发现，泌尿组织特异模块中的基因与中肾发生和发育、肾单位发生、肾小球生成、肾小管生成及肾上皮发育等肾脏发育相关功能密切相关，从功能上验证了研究中建立的模块与肾脏发育有关。

基于STRING 数据库［6］，本研究筛选了共表达模块中的关键基因，以此来集中体现共表达模块的生物学功能。在brown、green 及turquoise 共表达模块中共筛选到18个关键基因。这18个关键基因中，共有13个基因在正常AfcfRNA 中表达量高于P25，具有高表达特点。关键基因中，5 个来自brown 模块（CLCNKB、SLC6A18、NAT8、MIOX 及SLC3A1），8 个来 自turquoise 模 块（AQP2、CYP4A11、SLC7A9、SLC13A3、FXYD2、TRPV5、SLC17A1及BSND）。

CLCNKB 编码管基底氯通道ClC-Kb，其突变可以导致Ⅲ型Bartter综合征，表现为低血钾性碱中毒、肾素和醛固酮增高、肾小球旁器增生和肥大［7］。SLC6A18 是高表达在肾脏和小肠的氨基酸转运蛋白［8］，有研究表明其与中性氨基酸的吸收有关［9］。NAT8 编码肾脏和肝脏特异的乙酰转移酶，在肾小球功能调节中发挥重要作用［10］，其突变与肾功能衰竭的发生发展密切相关［11］。MIOX 编码肌醇加氧酶，其升高可以增强细胞内氧化还原反应，造成肾小管损伤［12］。SLC3A1编码胱氨酸摄取转运体，在肾脏表达量最高，期次是小肠和肝脏［13］，其突变可以导致胱氨酸尿和胱氨酸结石［14］。AQP2 是一种水通道蛋白，负责肾脏收集管水的重吸收，其突变可以导致严重的肾源性尿崩症［15-16］。CYP4A11 在肾远端小管高表 达［17］，其 基 因 多 态 性 与 高 血 压 密 切 相 关［18］。SLC7A9编码异二聚体氨基酸转运体蛋白，在肾脏远端小管胱氨酸重吸收中发挥重要作用，其突变与尿石症密切相关［19］。FXYD2 是Na+-K+-ATP 酶的γ 亚单位，与镁离子在肾脏的重吸收功能密切相关，其突变会导致高镁尿症和低镁血症［20］。TRPV5 编码肾脏瞬时受体电位香草酸5 亚型受体，是高选择性钙离子通道，参与肾脏钙离子的重吸收并维持钙离子稳态，其突变体是尿石症的遗传学基础［21］。SLC17A1 是肾脏尿酸转运蛋白，其无义突变会增加尿酸盐的排泄［22］。BSND 突变会导致Ⅳ型Bartter 综合征，表现为低钾血症、代谢性碱中毒、血清肾素活性升高及醛固酮增多症等［23］。

综上所述，本研究利用共表达网络分析和组织特异基因筛选的方法，分析孕中期正常胎儿AfcfRNA转录组，建立了泌尿系统发育相关的共表达网络；关键基因功能涉及中肾发生和发育、肾泡的发育、肾单位发生、肾小管生成、肾脏发育及泌尿生殖系统发生等。这些关键基因有望成为产前诊断中评估泌尿系统发育的标志物。