组蛋白修饰对神经发育影响及与神经发育障碍性疾病发病的关系

张骄，钟敏

重庆医科大学附属儿童医院康复科国家儿童健康与疾病临床医学研究中心儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室，重庆400014

儿童神经发育障碍（NDDs）是一组以认知、交流、行为或运动技能障碍为主要特征的疾病，具有高度的表型和遗传异质性。NDDs 包括语言障碍、智力障碍/全面性发育迟缓、癫痫、注意力缺陷多动障碍和孤独症谱系疾病等［1］。它们常不单独出现，往往伴随或合并其他功能障碍。NDDs 致病机制复杂，包括多种遗传性因素和环境危险因素等。表观遗传学包含染色体重塑、DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 等方式。组蛋白修饰是表观遗传学中重要的修饰方式之一，包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。组蛋白修饰参与DNA 转录调节、修复、复制、基因沉默及细胞分化等过程［2］，在神经发育中起着重要的调节作用，其水平异常可影响正常信号通路而致病。随着分子诊断技术的广泛应用，许多基因被发现，迄今为止确定编码蛋白的基因在某些保守途径发挥作用，如蛋白合成、修饰、突触信号或表观遗传调节等。其中编码组蛋白乙酰化或组蛋白甲基化相关蛋白的基因有CREBBP、EP300、KAT6A、KMT2D 等。现就组蛋白修饰对神经发育的影响及与NDDs发病的关系相关研究进行综述。

1 组蛋白修饰对神经发育的影响

组蛋白作为染色质基本结构蛋白，由H2A、H2B、H3、H4构成八聚体，周围缠绕着大约147 bp的DNA，连接组蛋白H1 锁定核小体两端的DNA。组蛋白翻译后修饰是基因表达的重要调节机制，这些修饰主要发生在组蛋白的N 端，通过一系列特定的酶或结合蛋白作为“书写器”“擦除器”“阅读器”来产生、消除或识别这些翻译后修饰，以精确调控“组蛋白密码”［3］。特定的修饰状态可影响组蛋白与DNA结合的亲和力，改变染色体构象或招募特定蛋白质影响基因活性，进而影响大脑发育、神经元分化及认知行为表型等［4］。组蛋白乙酰化及甲基化是最常见的两种修饰。

1.1 组蛋白乙酰化异常影响神经发育 组蛋白乙酰化是引起染色质结构改变、基因表观转录调控的的重要机制。组蛋白乙酰转移酶（HATs）与组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调节组蛋白乙酰化修饰水平。组蛋白乙酰化可促进转录因子招募到暴露的DNA，而去乙酰化则抑制转录活性，限制转录因子的获取，二者的平衡决定了多数动态表达基因的转录可及性和活性［5］。

HATs 根据催化结构域的不同，主要分为GNAT超家族、P300/CBP 家族、MYST 家族（包括Moz、Ybf2/Sas3、Sas2、Tip60 四个成员）三类［6］。HATs 异常与神经退行疾病的发生密切相关。MYST 家族中的Tip60 可控制神经元特异性基因表达，是神经系统发育与功能所必须的。Tip60 缺陷与突触囊泡扩张、神经传递缺陷、突触微管重排等有关。Tip60 对突触可塑性有促进作用，对学习与记忆功能起着重要作用［7］。另外，具有HATs活性的CBP在脑体积调节、神经细胞分化和神经前体细胞迁移中起着核心作用［8］。缺乏乙酰化活性的CBP 突变小鼠会出现长期记忆受损，而去乙酰化酶抑制剂可以增强长期记忆、提高突触可塑性，给予去乙酰化酶抑制剂可改善CBP突变小鼠的长期记忆［9］。

已报道的HDACs 有18 种，根据氨基酸序列可分为四大类（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类蛋白），这些酶通过锌依赖或NAD+依赖机制去乙酰化。HDACs 在不同的发育阶段及不同类型细胞之间有表达差异，通过影响组蛋白乙酰化水平来调控神经细胞增殖、分化、调亡、迁移及突触再生等，进而影响神经发育。产前HDAC1 或HDAC2 基因纯合缺失小鼠的大脑发育、脑结构及寿命无明显变化，而HDAC1、HDAC2 基因产前同时纯合缺失会导致大脑发育异常、胚胎死亡。研究显示，HDAC1、HDAC2 基因共同缺失可导致DNA 损伤、细胞增殖受阻、细胞调亡增多、神经中间祖细胞于异常区域增殖分化，造成大脑皮层畸形等［10-11］。此外，HDAC1、HDAC2 基因产前共同缺失可导致自发性小胶质细胞损伤，而对于成年人小胶质细胞，HDAC1、HDAC2 基因缺失没有出现细胞自发激活或凋亡的现象。HDAC1、HDAC2基因缺失会增强小胶质细胞淀粉样蛋白的吞噬，从而减少斑块负荷，防止认知能力下降［12］。

1.2 组蛋白甲基化影响神经发育 组蛋白甲基化是一种重要的组蛋白修饰，与组蛋白乙酰化修饰相似，组蛋白甲基化修饰由组蛋白甲基转移酶和组蛋白脱甲基化酶调控。但与组蛋白乙酰化生物效应不同，甲基化后激活或抑制基因转录的效应决于甲基化的位点、程度、模式及其发生的基因组环境。组蛋白甲基化主要通过影响RNA 聚合酶Ⅱ与基因结合或与DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等多种表观遗传修饰相互作用来调节基因转录。有实验表明，作为组蛋白甲基转移酶中的核受体结合SET 结构域（NSD）蛋白家族成员之一NSD2，在小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的增殖阶段其表达水平迅速升高，而在分化阶段其表达水平下降，提示NSD2 可能具有促进细胞增殖、抑制细胞分化的功能［13］。LSD1是最先发现的组蛋白赖氨酸脱甲基酶（KDM），其催化H3K4me1/2、H3K9me1/2 脱甲基化。LSD1 敲除的小鼠可在胚胎时期死亡。CHRISTOPHER 等［14］选择性敲除成年小鼠的LSD1 基因，小鼠大脑中LSD1 的缺失导致皮层和海马体中广泛的神经元死亡。KDM6B 是另一种组蛋白脱甲基化酶，据报道，其在有丝分裂后的神经元中发挥作用，调节突触功能。上述研究提示，组蛋白甲基化修饰在神经发育中发挥着重要作用。

2 组蛋白修饰异常与NDDs发病的关系

2.1 组蛋白乙酰化酶相关基因异常导致疾病

2.1.1 Rubinstein-Taybi 综合征（RTS） RTS 是一类以拇指/大趾粗大、幻觉、生长发育迟缓、智力障碍、特殊面容（如特征性“鬼笑脸”）和身材矮小为主要特征的罕见的常染色体显性遗传病。据文献报道，CREBBP、EP300基因突变与该疾病相关，它们分别编码cAMP 调节的增强子结合蛋白和E1A 结合蛋白，均含有HATs 活性。CREBBP、EP300 基因功能有一定重叠，但不能相互替代。由CREBBP 基因突变所致RTS 占50% ～70%，而EP300 基因突变所致的RTS较罕见。两种基因突变通过单倍体剂量不足或显性抑制效应［15］等机制影响组蛋白乙酰化。另外，有40%的RTS患者致病机制尚不明确。

果蝇中P300/CBP 家族的同源基因为nejire，在调控组蛋白乙酰化、调节突触发育和功能方面发挥重要作用。CREBBP、EP300基因纯合突变可致小鼠胚胎死亡；CREBBP、EP300 基因均杂合突变的小鼠也无法生存［16］；CREBBP、EP300 基因单杂合突变所致表型与RTS患者表型相似。在CREBBP 基因杂合突变小鼠中检测到组蛋白H2B 乙酰化水平降低，而EP300杂合突变小鼠乙酰化水平无明显改变。

2.1.2 KAT6A 综合征、Genitopatellar 综合征及SBBYSS 综合征 KAT6A 综合征是一种由染色体8p11上编码赖氨酸乙酰转移酶的KAT6A 基因突变所致的常染色体显性遗传病。KAT6A 基因包含18 个外显子，该基因编码的KAT6A 属于MYSY 家族的赖氨酸乙酰转移酶，可乙酰化组蛋白H3K9、K18、K23。KAT6A 基因突变可引起与神经及发育相关的罕见综合征，主要表现为肌张力低下、全面发育迟缓、喂养困难、小头畸形、心血管畸形、特殊面容（如鼻头宽、低耳位、薄上唇、宽额头、双侧颞骨窄）等。近端外显子1-15 突变的患者临床表现比远端外显子突变患者更轻。有学者推测近端外显子突变是由于蛋白质功能不足导致，而远端外显子突变可能是一种功能获得性突变或由显性抑制效应所致［17］。

位于染色体10q22.2 的KAT6B 基因所编码的HATs也属于MYSY 蛋白家族，该蛋白参与正反转录调控。KAT6B 突变导致KAT6B 基因相关疾病，如Genitopatellar 综合征（又称生殖器—髌骨综合征）和SBBYSS 综合征。这两种综合征有许多相似的临床表型，如智力障碍或全面发育迟缓、先天性心脏缺陷、骨骼发育不全和男性生殖器异常、牙齿和甲状腺异常、听力下降等。髋膝关节屈曲痉挛、足畸形、肾积水或肾囊肿、胼胝体发育不全为Genitopatellar 综合征的特有表型。面具脸、泪管异常和眼睑下垂、长拇趾仅存在于SBBYSS综合征［18-20］。因Genitopatellar综合征和SBBYSS 综合征临床表型相似、易于混淆，有学者提出了“KAT6B 谱系障碍”概念，多通过突变位置加以鉴别。根据基因型—表型可将KAT6B 突变分为4 组：第1 组突变（外显子15-16 及外显子17近端）与SBBYSS 相关；第2 组突变（外显子17 远端及外显子18 近端）与Genitopatellar 综合征相关；第3组突变（外显子18 内部，p.1350-p.1520）大多具有Genitopatellar/SBBYSS 混合表型；第4 组突变（外显子18远端）与SBBYSS相关［5，21］。

果蝇中可以找到与KAT6A、KAT6B 同源基因Enok，是影响神经母细胞增殖的关键因素。神经母细胞Enok 基因表达缺失导致HATs 活性异常，影响果蝇嗅觉及求偶记忆中心蘑菇体的发育［22］。KAT6A 基因敲除小鼠表现出胚胎致死性。KAT6A纯合缺失的小鼠出现颅面部发育异常、心脏缺陷，这与KAT6A 基因在颅面部发育过程中调控HOX 基因表达［23］、在心脏发育过程中抑制Tbx1基因和Tbx5基因表达［24］有关。而KAT6B 基因表达异常相关动物模型较少，KAT6B 异常小鼠表现为发育不良、颅面异常、体质量下降、大脑皮质减少等［25］。

2.2 HDACs 相关基因异常导致疾病 2q37 缺失综合征也称短指/趾—智力低下综合征或AHO-like 综合征，是由于2q37 部分片段缺失所致，缺失片段可含有多个基因，导致临床表型多样。研究表明，HDAC4 基因是2q37 缺失综合征致病的关键基因。2q37 缺失综合征主要表现为智力障碍、发育落后、自闭症、颅面部畸形（包括眉弓高突、V 形鼻尖、上唇薄、耳位低、头发稀疏等）、E 型短指/趾畸形、身材矮小、肥胖、睡眠障碍等。HDAC4基因定位于2q37.3，编码HDACs4，为Ⅱ型组蛋白脱乙酰酶。其在大脑神经元中广泛表达。越来越多的证据表明，HDAC4基因在神经功能中发挥重要作用。果蝇HDAC4 基因表达异常可导致长期记忆受损，可能是突触可塑性受损及与MEF2 不能正确定位进而影响蘑菇体发育。MEF2 家族在促进神经元存活、调节记忆形成及树突发生中有重要作用［26］。MEF2A、MEF2C 及MEF2D 在骨骼发育中不可或缺，与HDAC4 相互作用可影响骨骼及肌肉发育［27-28］。

2.3 组蛋白甲基化酶相关基因异常导致疾病

2.3.1 歌舞伎综合征 歌舞伎综合征是由Niikawa和Kuroki 于1981 年首次报道的一种罕见的累及多系统的先天性疾病。歌舞伎综合征以特殊面容、骨骼及皮纹异常、智力障碍、发育迟缓主要临床特征，其面容表现为眉外侧1/3稀疏或缺失、长脸裂、下眼睑外侧1/3 外翻、鼻柱短小、鼻尖凹陷、大而突出的耳朵等。歌舞伎综合征主要是由参与表观遗传调控的KMT2D、KDM6A 基因突变所致，其中由KMT2D突变所致者占50%～80%。因KMT2D 基因、KDM6A基因突变所致的临床表型存在一定差异，二者突变所致综合征被分别称为Kabuki 综合征1 型、Kabuki综合征2型，目前没有特征性表型来区分它们。

KMT2D 基因位于染色体12q13.12 上，编码一种组蛋白甲基转移酶，催化组蛋白H3 第4 位氨基酸（H3K4）甲基化。敲除KMT2D 或KMT6A 基因的斑马鱼表现出颅面部缺陷。H3K4 甲基化可调控与胚胎生长发育相关的基因转录。在小鼠模型中，完全敲除KMT2D 基因可致胚胎死亡［29］。KMT2D 杂合突变小鼠的海马齿状回颗粒细胞层神经生成减少，海马齿状回体积减少，这些小鼠在Morris水迷宫、场景恐惧实验和新物体识别实验中表现出记忆受损；在细胞分子水平上，此类小鼠颗粒细胞中的H3K4 甲基化水平显著下降［30］。在果蝇蘑菇体中，同源基因trr被敲除可导致果蝇短期记忆受损。

约5%的歌舞伎综合征是由于KDM6A 基因突变所致。KDM6A 基因位于Xp11.3，编码组蛋白脱甲基酶，作用于二甲基化或三甲基化的组蛋白H3第27 位赖氨基酸残基（H3K27）。现已证实KDM6A 是X 染色体失活逃逸基因，具有性别差异表达［31］。H3K4甲基化伴随着H3K27去甲基化［32］，故KMT2D、KDM6A 基因突变可致相似的综合征。KDM6A 的果蝇同源物dUtx 参与多种生物过程，如细胞自噬、Notch 信号通路通路、DNA 损伤反应等［22］。果蝇dUtx 去甲基酶活性在维持正常早期胚胎阶段及果蝇成虫的生存中有着重要作用［33］。

2.3.2 Sotos 综合征 Sotos 综合征又称脑性巨人症，是一种出生前或出生后过度生长的罕见常染色体显性遗传病，表现为体型巨大、出生后生长过快、特殊面容（巨头畸形、前额突起、下颌尖长、眼距宽等）、骨龄超前及发育落后等。大部分Sotos 综合征与NSD1 基因突变或NSD1 基因所在的染色体5q35微缺失有关，不同地区报道的这两种病因所占比例有所差异。NSD1 基因编码可甲基化组蛋白H3K36的甲基转移酶，其发挥激活转录或抑制转录作用取决于细胞所在环境［22］。NSD1 基因在人类和小鼠中高度保守。完全敲除NSD1 基因的小鼠胚胎无法存活，与野生小鼠相比，脑部体积缩小。但有报道称，NSD1基因杂合突变小鼠与纯合突变小鼠表型不同，杂合突变的小鼠未发生前脑体积减少，没有观察到皮质形态学异常，过度生长不明显并具有生存和生育能力［34-35］。果蝇中只有一种同源NSD 蛋白，Sotos综合征果蝇模型实验表明，NSD 纯合缺失导致的发育异常与人Sotos 综合征患者相似［36］。APC2 基因表达异常也可导致Sotos 综合征。NSD1 与APC2 相互作用使得皮层祖细胞正常迁移，NSD1 敲除可抑制APC2 表达，导致大量神经元留在皮层下。APC2 可能是NSD1 控制的关键下游基因，若两者相互关系被破坏，均可能导致Sotos综合征［37］。

2.3.3 Wiedemann-Steiner 综 合 征 Wiedemann-Steiner综合征是由KMT2A 基因突变引起的，主要表现为智力低下、特殊面容（面部圆扁、鼻子扁平、睑裂窄、短耳）、小头畸形、身材矮小、多毛及自闭症，是一种极其罕见的常染色体显性遗传的神经发育疾病。KMT2A 基因位于染色体11q23，编码可特异性甲基化H3K4 的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，在发育早期和造血功能中发挥重要作用。H3K4 特异性甲基转移酶KMT2A对海马突触可塑性至关重要，可能与认知功能障碍有关［38］。KMT2A 杂合突变的小鼠表现出长期恐怖记忆损害，KMT2A 基因敲除的小鼠海马神经元中H3K4 甲基化水平降低，与神经变性和记忆障碍模型小鼠中观察到的变化存在重叠［39］。由此可知，KMT2A 基因与神经发育及退行性病变的发生有关。

随着分子诊断技术的不断进步，表观遗传学与人类疾病有关的证据越来越多，学者们对表观遗传学疾病有了新的认识。组蛋白的表观遗传修饰与神经发育有密切关系。本研究描述了其中几种罕见的神经发育障碍性疾病。除此之外，HDAC6、KDM5C、EZH2、PRMT7 等组蛋白修饰相关基因异常也可导致不同的NDDs。由上述研究可知，参与组蛋白乙酰化或甲基化过程的酶完全缺乏常常导致胚胎死亡；通过单倍剂量不足机制致病的杂合突变可影响其编码产物参与生理过程稳态，导致儿童早期发病。无论是通过组蛋白甲基化还是乙酰化，都可影响单个基因或多个基因的调控，异常的调控导致信号通路异常，影响多种酶的功能，可导致多系统发育异常，故不同基因异常可能造成相同或相似的临床表现。另外，多种组蛋白表观修饰酶可调节其他非组蛋白系统。有证据表明，异常的组蛋白修饰在肿瘤细胞中被发现，肿瘤的发生、侵袭、转移与组蛋白表观修饰平衡失调密切相关。目前一些HDACs 及去甲基化酶抑制剂在抗肿瘤研究中取进展，如果它们通过临床试验，可能成为治疗NDDs 的有力候选药物。目前对组蛋白修饰与神经发育之间的相互作用机制知之甚少，进一步研究相关机制，可为神经发育障碍性疾病的治疗提供新的理论依据并为药物研究、开发提供新的思路。