miRNA-31-5p和SATB2的表达对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响机制

阿布都热合曼·买买提 戚峰

作者单位：①天津医科大学研究生学院（天津市300070）；②天津医科大学总医院普外科

乳腺癌严重威胁着女性的健康。研究显示，肿瘤的再次复发以及靶器官转移是导致晚期乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。深入揭示乳腺癌的发病、转移的分子机制，对于提高晚期乳腺癌患者的生存具有重要的临床价值。研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）通过调控靶基因的表达，发挥促癌或抑癌的调控功能[2]。miRNA-31-5p在胃癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中显示了良好的抑癌效用[3]。核基质结合蛋白质2（special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）是一种核转录因子，在遗传物质的重组和转录过程中发挥重要作用。Assarzadegan 等[4]通过对临床乳腺癌标本行免疫组织化学法染色显示，SATB2在乳腺癌中的表达明显升高，并与患者的不良预后密切相关，但并未深入揭示其表达与肿瘤细胞的增殖与转移的关系。本课题组前期通过对基因表达综合数据库（GEO）中提取乳腺癌数据集GSE24124、GSE70947、GSE42568 进行分析显示，miRNA-31-5p在乳腺癌中的表达明显降低，SATB2 基因的表达明显升高，并且两者的异常表达均与患者的预后关系密切。本研究通过对临床样本、乳腺癌细胞系的研究，探讨miRNA-31-5p和SATB2的表达对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响机制，为揭示乳腺癌的分子机制提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺癌组织样本 选取2017年3月至2020年12月于天津医科大学总医院收治的外科切除的80例乳腺癌患者的临床病理资料，平均年龄为（48.22±17.62）岁，所有入选样本均未经放化疗干预，组织病理学确诊为乳腺癌，另外选取80例相应的癌旁组织（远离病灶位置超过2 cm 以上）。所有样本收集后，以多聚甲醛固定，采用定量反转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测。本研究获得本院伦理委员会批准及患者的知情同意。

1.1.2 实验细胞 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 细胞株以及乳腺正常上皮细胞MCF-10A 均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。miRNA-31-5p 激动剂（miRNA-31-5p-agomir）和miRNA-31-5pagomir 对照（miRNA-31-5p-agomir-NC）以及pcDNA3.1-SATB2 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.3 实验动物 40 只（20±2）g的SPF 级雌性BALB/c 裸鼠均购自北京北方艾特生物科技有限公司，动物的生产许可证号为SCXK（京）2020-0005，并获得本院伦理委员会批准。

1.1.4 试剂与仪器 FBS、PBS 均购自美国CST 公司，GAPDH 抗体、SATB2、相关蛋白E-钙黏蛋白（Ecadherin）和波形蛋白（Vimentin）抗体均购自美国Invitrogen 公司，Western blot 试剂盒、Transwell 小室、EDU 增殖试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。C150 细胞培养箱购自德国Binder 公司，全自动凝胶成像系统、qRT-PCR 扩增仪均购自美国Bio-Rad 公司，光学显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 检测 Trizol 试剂盒分别提取样品的总RNA，确定其完整性和浓度后[5]，PCR 仪扩增。参照物GAPDH的上游序列为 5′-CCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTT-3′，下游序列为5′-CCACTGTGTTGAGGGCAATG-3′；miRNA-31-5p的上游序列为5′-GCAGACCGTTCGTCAACCTA-3′ ，下游序列为5′-AATTCTGTTTGCGGTGCGTC-3′；SATB2的mRNA上游序列为 5′-AACAGGAGGTCCCTACTCCC-3′，下游序列为5′-GCCATTTTGCGGTGGAAATG-3′。2−△△CT表示目的基因的相对表达量，△△CT=△CT（标准基因）−△CT（目的基因）。

1.2.2 双荧光素酶实验 TargetScanHuman 7.2 数据库（http://www.targetscan.org/vert_72/）预测miRNA-31-5p和SATB2的结合位点。采用双荧光素酶实验，将过表达miRNA-31-5p的质粒以及其对照分别与野生型（pGL3-SATB2-3-UTR-MUT）和突变型（pGL3-SATB2-3-UTR-WT）进行共转染，培养细胞48 h 后，洗涤细胞，加入适量裂解液，进行荧光素酶活性测定。

1.2.3 细胞转染实验 分组取对数生长期的MDAMB-231 细胞进行如下转染：正常组细胞常规培养，不进行任何干预；miRNA-31-5p-agomir 对照组细胞转染miRNA-31-5p-agomir-NC；miRNA-31-5p 激动剂组细胞转染miRNA-31-5p-agomir；pcDNA3.1 组细胞转染miRNA-31-5p-agomir+pcDNA3.1-SATB2。

1.2.4 EDU 染色实验 细胞分组处理同1.2.3，37℃，5%CO2条件下培养24 h，每孔加入100 μL的EDU染色液，室温孵育2 h，避光、孵育后，镜检，Image J 软件统计分析各组细胞EDU 阳性细胞的比例。

1.2.5 Transwell 小室实验 细胞分组处理同1.2.3，以无血清培养基悬浮细胞至1×105/mL，并接种在预先铺好50 μL的matrigel 基质胶的Transwell 小室上室中，37℃、5%CO2条件下进行培养24 h，经染色后，光学显微镜下观察，并行统计计数。

1.2.6 裸鼠皮下种植乳腺癌模型 将BALB/c 裸鼠随机分为正常组、miRNA-31-5p-agomir 对照组、miRNA-31-5p 激动组和pcDNA3.1 组，每组10 只。细胞分组处理同1.2.3，37℃、5%CO2条件下进行培养24 h，PBS 重悬细胞至4×107/mL，将100 μL的各组细胞皮下注射至对应组裸鼠的右侧前下肢外侧，同时腹腔注射适量的荧光剂Luciferin，连接活体成像系统（IVIS），以监测癌细胞的转移情况。各组裸鼠常规培养4 周后，处死，剥离肿瘤组织，天平称重，同时将瘤体组织进行Western blot 实验。

1.2.7 Western blot 实验 瘤体组织或细胞中添加适量的组织裂解液，提取其总蛋白，经电泳分离，转膜，封闭，加入一抗（1∶500），孵育，加入二抗（1∶1 500），化学发光后，显影，以GAPDH 作为参照分析各条带的灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，采用Graphpad8.1 进行作图。符合正态分布的实验数据采用±s进行表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中miRNA-31-5p和SATB2的表达

qRT-PCR 结果显示，与癌旁组织以及乳腺正常上皮细胞MCF-10A 相比，miRNA-31-5p在乳腺癌组织以及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDAMB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 中的表达明显降低，SATB2mRNA 表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图1）。因MDA-MB-231 细胞表现的差异最为明显，后续实验均使用MDA-MB-231 细胞。

2.2 双荧光素酶实验

TargetScanHuman 7.2 数据库中显示，miRNA-31-5p和SATB2 存在特异性结合的序列（图2A）。双荧光素酶实验结果显示，野生型SATB2的荧光素酶活性在转染miRNA-31-5p 模拟物后明显降低（P<0.05），突变型SATB2 荧光素酶活性无明显变化（P>0.05），说明miRNA-31-5p和SATB2 具有靶向调控关系（图2B）。

2.3 miRNA-31-5p 靶向SATB2 调控MDA-MB-231细胞的体外增殖与转移

EDU 染色实验结果显示，与正常组相比，miRNA-31-5p 激动剂组、pcDNA3.1 组中EDU 阳性细胞的比例明显降低，与miRNA-31-5p 激动剂组相比，pcDNA3.1 组EDU 阳性细胞的比例明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图3A）；Transwell 小室实验结果显示，与正常组相比，miRNA-31-5p 激动剂组、pcDNA3.1 组迁移细胞的数量明显减少，与miRNA-31-5p 激动剂组相比，pcDNA3.1 组迁移细胞的数量明显增多，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图3B）；Western blot 结果显示，与正常组相比，miRNA-31-5p 激动剂组、pcDNA3.1 组细胞SATB2、Vimentin的表达明显降低，E-cadherin的表达明显升高，与miRNA-31-5p 激动剂组相比，pcDNA3.1 组细胞SATB2、Vimentin的表达明显升高，E-cadherin的表达明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05，图3C）。

2.4 miRNA-31-5p 靶向SATB2 调控MDA-MB-231细胞的体内生长与转移

裸鼠皮下种植乳腺癌模型结果显示，与正常组相比，miRNA-31-5p-agomir 组、pcDNA3.1 组的瘤体质量以及病灶转移的比例明显降低，与miRNA-31-5pagomir 组相比，pcDNA3.1 组的瘤体质量以及病灶转移的比例明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图4A～B）；Western blot 结果显示，与正常组相比，miRNA-31-5p-agomir 组、pcDNA3.1 组瘤体内SATB2、Vimentin的表达明显降低，E-cadherin的表达明显升高，与miRNA-31-5p-agomir组相比，pcDNA3.1组瘤体内SATB2、Vimentin的表达明显升高，E-cadherin的表达明显降低，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图4C）。

3 讨论

尽管乳腺癌的诊断、治疗以及预后均有较为明显的进步，但该病的长期生存率仍未令人满意。因此，揭示乳腺癌细胞增殖和转移的分子途径，寻找可靠的治疗靶点，是亟需解决的挑战之一。

miRNAs 调控癌细胞的增殖、凋亡、侵袭与转移等生理过程。研究显示， miRNA-31-5p在结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌等恶性肿瘤中的表达异常，并影响患者预后[6]。Chen 等[7]研究显示，在肝癌组织中，过表达miRNA-31-5p 后，癌细胞的增殖与侵袭能力随之下降。Zhao 等[8]研究显示，升高miRNA-31-5p在前列腺癌细胞系中的表达后，肿瘤细胞的体内生长与转移能力明显下降。曾国栋等[9]研究显示，miRNA-31-5p在乳腺癌组织中的表达降低，升高miRNA-31-5p的表达能明显调控肿瘤细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、E-cadherin和Vimentin的表达，但未揭示miRNA-31-5 与乳腺癌细胞的增殖与转移的分子调控机制。本研究结果显示，miRNA-31-5p在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDAMB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 中的表达明显降低，过表达miRNA-31-5p 后，MDA-MB-231 细胞的体外增殖与转移，体内生长与转移能力明显下降，这些结果显示了miRNA-31-5p 作为治疗乳腺癌靶点的良好前景。

SATB2的基因能编码733 个氨基酸，定位于2号染色体上，物种的进化上高度保守。研究显示，SATB2 能与核基质紧密结合区的序列进行特异性结合，直接帮助肿瘤细胞进行转移和免疫逃逸[10]。SATB2在结肠癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌等肿瘤中表达异常，参与调控肿瘤细胞的增殖、分化、运动、衰老等生物学过程[11]。Roy 等[12]研究指出，SATB2在结肠癌、鼻咽癌、胶质瘤等多种肿瘤中表达升高，诱导癌细胞EMT，成为实体恶性肿瘤治疗的靶点。Wang 等[13]研究显示，沉默SATB2在肝癌的表达后，能明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，并逆转肿瘤细胞的EMT。本研究中qRT-PCR 结果显示，SATB2在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系的表达均明显升高，在MDA-MB-231 细胞中的表达升高尤为明显；双荧光素酶实验结果显示，miRNA-31-5p 能靶向调控SATB2 表达，转染pcDN A3.1-SATB2 可部分逆转miRNA-31-5p 对MDA-MB-231 细胞增殖和转移的抑制作用。

综上所述，在乳腺癌中miRNA-31-5p 表达降低，SATB2 表达升高，过表达miRNA-31-5p 后能明显抑制MDA-MB-231 细胞的体外增殖与转移以及体内生长与转移能力，但转染pcDNA3.1-SATB2 可部分逆转这一抑制作用。但如何将两者的靶向作用制备成可实用的技术探针在乳腺癌的诊断与治疗中发挥作用，还需要更为系统、更多学科的综合研究。