下调微小RNA-425-5p靶向第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白调控宫颈癌细胞侵袭和迁移的分子机制

李敏，赵妍丽，杜国波

作者单位：川北医学院附属医院肿瘤科，四川 南充637000

宫颈癌作为一种常见的恶性肿瘤，其分子发生机制十分复杂，宫颈癌发生与肿瘤组织中异常表达的基因有关［1］。研究报道表明，肿瘤中异常表达的基因可以通过影响肿瘤细胞生长、转移等生物学行为参与肿瘤进展，靶向基因治疗肿瘤是目前研究的重点［2］。微小RNA（miRNA/miR）是由19～24 个核苷酸组成的小分子RNA，miRNA 的产生需要经过细胞核内、细胞质等加工程序，并且每个miRNA 可能有成千上百个作用位点，在不同组织的不同生理进程中参与调控下游蛋白表达［3］。miRNA在物种间的表达具有时序性、保守型性以及组织特异性，参与细胞生长、病变等过程［4］。miRNA 与肿瘤的发生和转移有关，其参与调控肿瘤细胞恶性表型转化［5］。研究报道显示，miR-425-5p 在肾癌、胃癌等组织和细胞中表达上调，下调其表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移［6-7］。目前已知miR-425-5p 在宫颈癌中表达上调，其高表达与宫颈癌病人肿瘤高分期以及淋巴结转移呈正相关，并且高表达miR-425-5p 的病人生存率较低，下调miR-425-5p 表达可以诱导宫颈癌细胞凋亡［8-9］。现阶段对于下调miR-425-5p 对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响还不明确。

2018 年12 月至2019 年11 月，本研究以宫颈癌Caski细胞为研究对象，通过转染miR-425-5p抑制剂（inhibitor）下调miR-425-5p 表达水平，探讨下调miR-425-5p对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）抗体、神经钙黏素（N-cadherin）抗体购自北京百奥莱博科技有限公司；宫颈癌Caski 细胞购自上海沪震生物科技有限公司；上皮钙黏素（Ecadherin）抗体购自美国Proteintech Group；miR-425-5p inhibitor 和抑制剂对照（inhibitor control）由杭州泰禾生物技术有限公司构建合成；Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen；siRNA control、PTEN siR‑NA购自吉满生物科技（上海）有限公司。

1.2 细胞转染宫颈癌Caski细胞中分别转染miR-425-5p inhibitor 和inhibitor control，转染具体步骤参照Lipofectamine 2000 转染试剂具体操作说明书。设置没转染的Caski 细胞为Control 组，依次把转染miR-425-5p inhibitor、inhibitor control 以后的宫颈癌Caski细胞设置为Anti-miR-425-5p和Anti-NC组。

1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）测定miR-425-5p inhibitor 对细胞中miR-425-5p 表达影响收集转染24 h 以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 组细胞，添加Trizol 试剂，分别将各组细胞中的总RNA 提取并保存在−20 ℃。RNA 浓度测定用紫外分光光度计检测。取1 µg 的RNA，分别添加以下试剂，配制逆转录体系，添加试剂包括：1µL 的逆转录酶、1µL 的5×Buffer、1µL 的2.5 U/µL的多腺苷酸聚合酶，添加双蒸水至25µL，瞬时离心，按照37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min 的逆转录程序合成互补DNA（cDNA）。以cDNA 为模板，进行qRT-PCR 检测，配制反应体系如下：2µL 的miRNA qPCR Primer、10 µL 的2×All-in-one qPCR Mix、2 µL 的Vniversal Adaptor PCR、2 µL 的cDNA，添加双蒸水至20 µL，PCR 反应程序为：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，15 s。按照公式2−ΔΔCt计算miR-425-5p相对表达水平。

引物序列：miR-425-5p 正向5’-GGGGAGTTAG‑GATTAGGTC-3’，反向5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

1.4 MTT 法测定miR-425-5p inhibitor 对细胞增殖影响按照Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 组分组方法将宫颈癌Caski 细胞分别种植在96 孔板内，每孔中吸取100µL 细胞培养液（约含有5 000个细胞），放在37 ℃，饱和湿度，5%二氧化碳培养箱中培养24 h。取出培养板，用移液枪分别在每个孔内添加15µL 的MTT，将培养板继续放置在37 ℃环境下孵育4 h。吸弃上清溶液，添加二甲基亚砜（Di‑methyl sulphoxide，DMSO）各150 µL，观察结晶物完全溶解以后，调整酶标仪波长为470 nm，检测每个孔的吸光度，以此表示细胞增殖能力。

1.5 Transwell 小室方法分别检测miR-425-5p in⁃hibitor 对侵袭和迁移能力的影响Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p组细胞分别悬浮在无血清的培养液中（细胞密度为2×103个/毫升），吸取200µL 分别添加到Transwell 小室的上室中，加含血清细胞培养液500µL到下室，24 h后，擦掉多余的细胞，固定（4%多聚甲醛），染色（0.1%结晶紫）。分别计数各组细胞迁移数目。侵袭实验前需用基质胶将小室湿化。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）分别测定Ncadherin、E-cadherin 蛋白表达Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 组细胞培养24 h 以后常规方法提取细胞中的总蛋白。蛋白浓度定量用BCA 法，步骤完全按照试剂盒说明进行。灌制10%分离胶和5%的浓缩胶，在电泳槽中添加电泳缓冲液，每孔50µg样品，80 V 电泳30 min，120 V 电泳1.5 h。根据目的蛋白的数量和大小，将硝酸纤维素膜（NC 膜）裁剪，浸泡至甲醇中。转膜电流为200 mA，转膜装置放在冰上进行，转膜持续50 min。NC 膜放在新配置的5%脱脂奶粉中孵育2 h；NC膜与一抗、二抗孵育，用化学发光试剂ECL 显色。N-cadherin、E-cadherin一抗以1∶800 稀释，二抗以1∶2 000 稀释。利用Im‑age J 分析各组目的和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）灰度值，比较目的蛋白的表达差异。

1.7 靶基因预测以及鉴定Targetscan 生物信息学软件预测miR-425-5p 靶基因，结果发现PTEN 和miR-425-5p 可能互为靶向关系。把突变型载体MUT［PTEN 3′非翻译区（UTR）端互补序列突变］、野生型载体WT（PTEN 3′UTR 端互补序列无突变），分别与miR-425-5p inhibitor、inhibitor control 共转染至宫颈癌Caski 细胞内，用荧光素酶活性检测试剂盒检测24 h 各组细胞中荧光素酶活性的变化。MUT 和WT 分别由南京科佰生物科技有限公司构建。

1.8 PTEN siRNA 影响下调miR-425-5p 的细胞增殖、侵袭和迁移检测用Lipofectamine 2000 分别将siRNA control、miR-425-5p inhibitor 和PTEN siRNA、miR-425-5p inhibitor 共转染到宫颈癌Caski 细胞中，分别命名为Anti-miR-425-5p+si-NC 和Anti-miR-425-5p+si-PTEN 组。MTT 法测定细胞增殖，Tran‑swell 小室测定细胞侵袭和迁移，蛋白质印迹法测定N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白表达，步骤同上。

1.9 统计学方法利用SPSS 21.0 软件分析数据，计量资料满足正态分布，按照±s表示，两组之间的比较采用成组t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析+LSD 法，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-425-5p inhibitor 对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响在宫颈癌细胞中转染miR-425-5p inhibitor，细胞中miR-425-5p 表达水平下降，吸光度降低，侵袭数目以及迁移数目减少，N-cad‑herin 蛋白表达减少，E-cadherin 蛋白表达增多（均P<0.05）。miR-425-5p inhibitor降低宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间充质转化（EMT）水平。见图1，2；表1。

表1 miR-425-5p inhibitor转染前后宫颈癌细胞中miR-425-5p水平、吸光度、侵袭数目、迁移数目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白水平比较/± s

表1 miR-425-5p inhibitor转染前后宫颈癌细胞中miR-425-5p水平、吸光度、侵袭数目、迁移数目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白水平比较/± s

注：N-cadherin为神经钙黏素，E-cadherin为上皮钙黏素。①与Anti-NC组比，P<0.05。

组别Control Anti-NC Anti-miR-425-5p F值P值E-cadherin 0.28±0.03 0.29±0.05 0.65±0.07①144.47<0.001重复次数999 miR-425-5p 1.00±0.09 0.96±0.15 0.32±0.04①122.10<0.001吸光度0.45±0.06 0.47±0.05 0.23±0.04①62.18<0.001侵袭数目96.25±9.51 95.32±7.86 63.17±5.22①53.38<0.001迁移数目138.47±12.14 140.88±13.94 89.64±9.57①52.09<0.001 N-cadherin 0.60±0.05 0.59±0.04 0.30±0.04①137.48<0.001

图2 蛋白质印迹法检测各组宫颈癌细胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表达

2.2 miR-425-5p 和PTEN 靶向关系预测和鉴定生物信息学软件发现miR-425-5p 和PTEN 有互补结合位点，WT 和miR-425-5p inhibitor 共转染后的宫颈癌细胞荧光素酶活性升高（P<0.05），见表2。miR-425-5p和PTEN互为靶向关系。

表2 两组突变型载体MUT、野生型载体WT荧光素酶活性比较/± s

表2 两组突变型载体MUT、野生型载体WT荧光素酶活性比较/± s

组别Anti-NC Anti-miR-425-5p t值P值重复次数99 MUT 1.00±0.11 0.97±0.09 0.63 0.540 WT 1.00±0.13 2.68±0.23 19.08<0.001

2.3 下调miR-425-5p 对宫颈癌细胞中PTEN 蛋白表达影响Control 组、Anti-NC 组、Anti-miR-425-5p组宫颈癌细胞中PTEN 蛋白水平分别为（0.46±0.05）、（0.45±0.03）、（0.92±0.08），三组比较差异有统计学意义（F=198.61，P<0.001），宫颈癌细胞转染miR-425-5p inhibitor 以后，细胞中PTEN 蛋白表达水平升高（P<0.05），见图3。下调miR-425-5p 促进宫颈癌细胞中PTEN蛋白表达。

图3 蛋白质印迹法检测各组宫颈癌细胞PTEN蛋白表达

2.4 PTEN siRNA 对下调miR-425-5p 的宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力影响与共转染siRNA control、miR-425-5p inhibitor 比较，共转染PTEN siR‑NA、miR-425-5p inhibitor后的宫颈癌细胞吸光度、侵袭数目、迁移数目均升高，PTEN 蛋白水平降低，Ncadherin 蛋白水平则升高，E-cadherin 蛋白表达水平下降（P<0.05），见图4，表3。

表3 PTEN siRNA转染前后的下调miR-425-5p宫颈癌细胞吸光度、侵袭数目、迁移数目以及N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白水平比较/± s

表3 PTEN siRNA转染前后的下调miR-425-5p宫颈癌细胞吸光度、侵袭数目、迁移数目以及N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白水平比较/± s

注：PTEN为第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白，N-cadherin为神经钙黏素，E-cadherin为上皮钙黏素。

组别Anti-miR-425-5p+si-NC Anti-miR-425-5p+si-PTEN t值P值PTEN 0.89±0.10 0.44±0.04 12.53<0.001重复次数99吸光度0.22±0.03 0.39±0.04 10.20<0.001侵袭数目68.31±7.83 88.73±5.24 6.50<0.001迁移数目92.37±6.97 128.43±10.76 8.44<0.001 N-cadherin 0.32±0.03 0.63±0.06 13.86<0.001 E-cadherin 0.60±0.05 0.41±0.04 8.90<0.001

图4 蛋白质印迹法检测各组宫颈癌细胞PTEN、N-cadherin、E-cad‑herin蛋白表达

3 讨论

miRNA 是由其初始产物在细胞核内经过RNA聚合酶Ⅱ特异性作用而形成的［10］。miRNA 生物学功能较多，在不同的组织中表达水平不同，miRNA可能参与决定细胞以及组织的功能特异性［11］。miRNA 与肿瘤的关系十分密切，其在肿瘤进展中发挥类似癌基因或抑癌基因的作用，改变其表达可能是肿瘤治疗的途径［12］。miR-425-5p 在人体中作用广泛，与脂肪细胞分化、心肌纤维化等有关，miR-425-5p 通过调控细胞的增殖、分化等过程参与疾病进展［13-14］。miR-425-5p 在肾癌细胞和组织中高表达，miR-425-5p 在肾癌细胞恶性生长中发挥促进作用［6］。在胃癌等肿瘤中发现miR-425-5p能够正调控肿瘤细胞的侵袭和迁移，下调其表达能够降低肿瘤细胞的转移潜能［7］。既往的研究显示，miR-425-5p在宫颈癌中高表达与病人的淋巴结转移有关，下调miR-425-5p 诱导宫颈癌细胞凋亡［8-9］。本次研究显示，下调miR-425-5p 后的宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降，提示下调miR-425-5p 抑制宫颈癌细胞转移潜能，这与以前的研究结果相符合，提示miR-425-5p在肿瘤转移中可能发挥促进作用。

N-cadherin 是间质细胞标志蛋白，E-cadherin 是上皮细胞标志蛋白，其表达水平的改变与细胞EMT水平有关［15］。另外，N-cadherin 是一个在肿瘤中高表达的癌基因，而E-cadherin 是在肿瘤中低表达的抑癌基因，二者表达改变与肿瘤的进展有关［16］。我们的实验结果表明，下调miR-425-5p 后的宫颈癌细胞中N-cadherin 蛋白表达水平下降，E-cadherin 蛋白表达水平升高，提示下调miR-425-5p 抑制宫颈癌细胞EMT。研究显示，肿瘤细胞EMT 发生在肿瘤转移之前，其EMT水平越高细胞转移能力也就越强［17-18］。本实验结果充分证实，下调miR-425-5p 可以降低宫颈癌细胞转移潜能。

研究报道显示，miRNA 的作用靶点有多个，其与蛋白质的调控因子不同，miRNA 能够在高层次影响细胞生物学行为，miRNA 在不同的生理或病理进程中调控的靶基因可能不同，这也是miRNA 功能多样的重要原因［19-20］。在乳腺癌中的研究显示，miR-425-5p 可以通过靶向调控PTEN 影响肿瘤进展［21］。我们的实验表明，miR-425-5p 能够负调控宫颈癌细胞中PTEN 蛋白表达，提示miR-425-5p 参与宫颈癌进展可能也与PTEN 有关。PTEN 是一个与细胞生长有关的抑癌基因，其在宫颈癌中表达下调，上调可以显著抑制肿瘤细胞的转移潜能［22］。本研究表明，降低PTEN 表达可以部分逆转抑制miR-425-5p抗宫颈癌细胞增殖和侵袭、迁移以及EMT 功能，下调miR-425-5p 影响宫颈癌细胞转移潜能作用机制与靶向调控PTEN 有关，这与上述研究结果相符合，说明下调miR-425-5p 对肿瘤影响的作用机制与PTEN有关。

总之，下调miR-425-5p 具有抑制宫颈癌细胞侵袭和迁移的作用，机制与PTEN 有关，miR-425-5p 可能促进宫颈癌转移。宫颈癌的分子发生机制较为复杂，今后会在多株宫颈癌细胞以及体内验证miR-425-5p的作用及下游调控机制。（本文图1见封三）