布地奈德对小鼠肺组织OPN和α-SMA表达的影响及意义

卢飞艳 宋文秀 何月贤 蒋铁汉

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起5 岁以下儿童急性呼吸道感染的最常见也是最重要的病原体之一，呈全球广泛流行，感染后不能获得免疫，对儿童健康造成一定危害。儿童早期由感染RSV 后所诱发的毛细支气管炎（以下简称毛支炎）与后期反复喘息，甚至发展为哮喘关系密切[1]。糖皮质激素是目前有效的抗气道炎症药物，临床上对RSV 感染多以推荐吸入用布地奈德为代表的局部雾化治疗[2]。然而临床上长期、高频率地使用激素治疗的副作用也令人担忧。本研究自2015 年07 月—2016 年9 月完成前期研究工作，2018 年01 月立项后至2019 年12 月完成实验。主要通过制作实验动物模型，并通过布地奈德雾化干预治疗，动态观察气道病理改变及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的动态变化，探讨布地奈德对RSV 感染后肺组织的改善效用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

体质量15～20 g、年龄4 周龄的健康雌性BALB/c小鼠（购自广东省实验动物中心）；吸入用布地奈德混悬液（AstraZeneca Pty Ltd 生产）；RSV A2 株购自广州博特生物科技有限公司、部分由其他课题组赠送；OPN兔抗鼠一抗抗体（购自Santa Cruz Biotechnology）；α-SMA 兔抗小鼠一抗抗体、SABC 免疫组化试剂盒、PBS 缓冲液、枸橼酸盐缓冲液等均购自武汉博士德生物技术有限公司。本课题已通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立

72 只BALB/c 小鼠按照完全随机法将小鼠分为三组[3]：空白对照组（以下简称对照组）、观察组（RSV 感染组）、布地奈德干预组（以下又称干预组），每组24 只小鼠。各组小鼠分别行腹腔注射麻醉，对照组小鼠麻醉后予0.9%氯化钠注射液（生理盐水）100μL 经鼻内滴入，其余两组小鼠均予以106PFU 的RSV 病毒液100 μL[4]经鼻内滴入。24 h 后布地奈德干预组予吸入用布地奈德混悬液每天1 次雾化吸入（剂量：1 mg/次）30 min[5]。其余两组给予等剂量的生理盐水雾化治疗，每天1 次。

1.2.2 实验小鼠肺组织标本取材及HE 染色

分别于第4、8、14、28 d 随机在各组组内选取6 只小鼠并处死，切下左肺后固定24 h，分取小块肺组织，不同梯度酒精脱水、透明、石蜡包埋、切片、玻片固定。干燥，予脱蜡、梯度酒精直至蒸馏水，HE 染色[3]，中性树胶封片，光镜下观察支气管—肺组织病理改变并采集图片。

1.2.3 Masson 染色小鼠肺组织胶原沉积

脱蜡至水，按照Masson 染色试剂盒说明书步骤进行Masson 染色，脱水、透明、中性树胶封固。光镜下观察、采图、分析计算[6]。

1.2.4 免疫组化法检测肺组织OPN、α-SMA 的表达

按照免疫组化法及试剂盒说明书检测肺组织OPN、α-SMA 的表达[6]；阴性对照的一抗用PBS 液替代；显微镜下阅片、采图、分析计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计量资料采用（）表示，若实验数据符合正态分布和方差齐性，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两间比较采用LSD-t检验。若实验数据不符合正态分布和方差齐性，两组间比较行Tamhane’s 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色观察各组肺组织病理改变

空白对照组与观察组研究结果同前期研究[6]。布地奈德干预组小鼠肺组织较同期观察组炎性细胞浸润减少，气道黏膜皱褶及气道平滑肌增厚程度较同期观察组减少，肺泡壁充血、水肿较同期观察组好转。

2.2 Masson 染色法计算气道外周胶原沉积面积百分比

空白对照组气道壁周围偶可见散在少许蓝色胶原沉积；与空白对照组相应时间点两两比较，观察组及布地奈德干预组在感染的第4 d、第8 d 及第14 d 气道外周胶原沉积面积百分比增多，差异均有统计学意义（P＜0.05），感染第28 d组间差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组与空白对照组比较结果与前期研究相符[6]。与观察组相应时间点比较，布地奈德干预组第4 d、第8 d 及第14 d 气道外周胶原沉积面积百分比减少，差异有统计学意义（P＜0.05），第28 d 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1、图2、图3。

图1 对照组各时间点小鼠肺组织气道外周胶原情况（Masson 染色，×200）

图2 观察组各时间点小鼠肺组织气道外周胶原情况（Masson 染色，×200）

图3 布地奈德干预组各时间点小鼠肺组织气道外周胶原情况（Masson 染色，×200）

表1 各时间点各组小鼠气道外周胶原沉积面积百分比（%，，n=6）

表1 各时间点各组小鼠气道外周胶原沉积面积百分比（%，，n=6）

注：与对照组比较，＊P ＜0.05；与感染组比较，#P ＜0.05。

2.3 各组小鼠肺组织OPN 表达结果

空白对照组小鼠肺组织中 OPN 表达均为弱阳性，颗粒颜色较浅；与空白对照组相应时间点比较，观察组第4 d、第8 d、第14 d OPN 表达增加（P＜0.05），第28 d差异无统计学意义（P＞0.05）；布地奈德干预组第4 d、第8 d OPN 表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），第14 d、第28 d 差异无统计学意义（P＞0.05）。与观察组相应时间点比较，布地奈德干预组第8 d、第14 d OPN 表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；第4 d、第28 d 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图4、图5、图6。

图4 空白对照组小鼠肺组织OPN 免疫组化（×400）

图5 观察组小鼠肺组织OPN 免疫组化（×400）

图6 布地奈德干预组各时间点小鼠肺组织OPN免疫组化（×400）

表2 各组各时间点肺组织OPN 平均光密度值（，n=6）

表2 各组各时间点肺组织OPN 平均光密度值（，n=6）

注：与对照组比较，＊P ＜0.05；与感染组比较，#P ＜0.05。

2.4 各组小鼠肺组织α-SMA 表达结果

空白对照组小鼠肺组织中α-SMA 表达均为弱阳性，颗粒颜色浅。与空白对照组相应时间点相比较，观察组第4 d、第8 d、第14 d α-SMA 表达增加（P＜0.05），第28 d 差异无统计学意义（P＞0.05），该结果与前期研究相符[6]；布地奈德干预组第4 d、第8 d、第14 d α-SMA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），第28 d 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与观察组相对应时间点比较，布地奈德干预组第8 d、第14 d α-SMA 表达均有所减少（P＜0.05）；第4 d、第28 d 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组各时间点肺组织α-SMA 平均光密度值比较（，n=6）

表3 各组各时间点肺组织α-SMA 平均光密度值比较（，n=6）

注：与对照组比较，＊P ＜0.05；与感染组比较，#P ＜0.05。

3 讨论

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起儿童呼吸道感染的需重点防范的主要病毒之一[7]，由其引起的下呼吸道病毒感染是婴幼儿发病率和死亡率的主要原因[8]。婴幼儿时期的RSV 毛支炎与儿童时期发生哮喘密切相关已得到临床证实[9-10]。研究显示对于严重RSV 感染的毛支炎患儿约近一半在6 岁时出现肺功能减低、喘息及哮喘，并可影响至青春期，甚至成年期[11]。目前对RSV 感染临床上仍以吸入用布地奈德为代表的局

部雾化作为推荐治疗方法之一。本研究通过制作实验动物模型，予布地奈德雾化干预治疗，从而探讨布地奈德对RSV 感染后肺组织的改善效用。

3.1 OPN 在RSV 感染中的作用

OPN 是细胞外基质中一种重要的磷酸化糖蛋白，可发挥多种的生物学效应，并参与机体多种病理状态炎症反应，在机体炎症反应和免疫应答中起重要作用[12]。作为一种新型生物标志物，OPN 与哮喘的气道炎症、气道重塑之间的联系密不可分[13]。本实验研究发现：RSV 感染组小鼠肺组织HE 染色呈现典型的间质性肺炎表现，而本实验免疫组化法检测OPN 结果显示：OPN 表达量与RSV 感染小鼠肺组织病理学在气道炎症的改变规律一致，从而推测OPN 可能参与了RSV 感染后气道炎症的发生、发展。最近有研究发现，OPN在机体气管平滑肌的纤维化和气管重塑中亦有密切参与，主要通过上调相关因子的表达水平促使气管平滑肌的纤维化增强[14-15]，从而表明OPN 在哮喘气道重塑的形成中发挥作用。本实验中从RSV 感染小鼠肺组织免疫组化OPN 阳性表达量规律中可推测，OPN 可能参与RSV 感染胶原沉积的产生过程。虽然OPN 在第14 d 较第8 d 稍减少，但仍处于强阳性表达，而Masson 染色中胶原沉积在感染第14 d 增加最明显，OPN 在气道并未呈现时间依赖性的增加，其具体原因尚需进一步研究。

3.2 a-SMA 在RSV 感染中的作用

α-SMA 是平滑肌的特征性标志物，可直接作用于气道平滑肌，其表达过量可引起气道平滑肌的一系列改变如气管收缩、管腔狭窄、迁移等，从而加重气道炎症和气道重塑[16]。本实验前期研究免疫组化法检测α-SMA表达结果显示：RSV 感染小鼠肺组织α-SMA 阳性表达变化与Masson 染色中胶原沉积的变化规律一致，从而推测，α-SMA 可能参与到了RSV 感染胶原沉积的产生过程[6]。另本实验发现：a-SMA 表达量在感染第4 d 开始出现，第8 d 表达量明显增加，与本研究RSV 感染小鼠肺组织HE 染色在气道炎症的改变规律一致，不排除α-SMA 可能参与了RSV 感染后气道炎症的发生、发展，但第14 d 及第28 d 的改变规律并不一致，其原因仍有待进一步研究。

3.3 布地奈德干预治疗对RSV 感染小鼠肺组织的病理改变及对OPN、α-SMA 表达的影响

目前，对于儿童哮喘的治疗手段之一仍是以布地奈德为代表的局部糖皮质激素雾化吸入，目前也是儿童RSV 感染的治疗手段之一。布地奈德具有局部抗炎作用，且作用高效又稳定，在临床使用中可达到抑制机体炎症、减轻支气管平滑肌收缩的治疗目的[17]。雾化吸入可将高浓度的布地奈德药物直接作用于靶器官，操作简单，药物剂量少，且治疗时间较短，能迅速而有效地缓解临床症状[18]。

本研究HE 染色结果发现，与同期观察组比较，布地奈德干预组肺组织炎症减轻。Masson 染色结果发现布地奈德干预组在第4、8、14 d 分别与同期观察组比较胶原沉积明显减少，尤其是在第14 d，该结果与既往的一些研究结果相符[3]。免疫组化检测OPN 及α-SMA 的表达发现：布地奈德干预组小鼠肺组织OPN 和α-SMA的表达均较观察组有所下降，同时肺组织的炎症表达亦有所减轻，提示布地奈德可能通过减少 OPN 及α-SMA的表达从而减轻 RSV 感染后的肺部炎症。另外小鼠肺组织胶原沉积随之减少，同样可认为布地奈德可能通过减少肺部OPN 和α-SMA 的表达来减少小鼠肺组织胶原沉积。布地奈德干预治疗后气道胶原沉积在第14 d 明显减少，但未完全消失，提示RSV 感染后即使治疗，气道胶原沉积时间仍相对较长，从一定程度度上说明临床上予以吸入用布地奈德为代表的糖皮质激素治疗儿童RSV 感染效果是明显的，但临床使用糖皮质激素治疗的疗程尚未确定。本实验予布地奈德雾化治疗3 d，只有一个治疗时间参考点，更多的雾化治疗时间点对比效果会不会更好更突出，仍值得我们进一步研究。

综上所述，我们可以得出以下结论：（1）OPN 与α-SMA 可能参与了RSV 感染小鼠气道炎症及气道胶原沉积过程；（2）布地奈德可能通过降低OPN 和α-SMA的表达来减轻RSV 感染引发的气道炎症及胶原沉积。