益肾骨康方对骨转移癌痛大鼠骨质破坏的影响

梁 敏，芦殿荣*，何理玉，冯 利

（1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，北京 100021）

骨骼是肿瘤转移细胞主要的目标器官之一[1]，转移率仅次于肺和肝[2]。乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾癌、肝癌等是常见发生骨转移的恶性肿瘤[3]。疼痛是骨转移癌较早出现的临床症状，给患者的生活质量造成严重的影响。多数患者最初经历间歇性的钝痛，但随着病情的进展，疼痛逐步转化为持续性的钝痛或刀割样痛，活动时加剧[4]。75%的病人忍受着由癌症引起的致残性骨痛，开发新的药物及寻找更好的治疗方法是目前研究热点和难点[5]。课题组前期研究发现，益肾骨康方在治疗癌性躯体痛方面具有更好的止痛效果，改善患者生活质量，不良反应更低[6-9]。本研究通过建立大鼠骨转移癌痛模型，观察益肾骨康方（专利号：ZL2013 1 0582907.9，专利权人：冯利）及其拆方对模型大鼠骨质破坏的影响，评价益肾骨康方治疗骨转移癌痛的止痛以及骨保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 48 只SPF 级雌性SD 大鼠，体质量（200±20 ）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2016-0006。饲养于中央民族大学中药学院动物研究中心，符合动物伦理相关规定。大鼠饲养温度（25±0.5）℃，自由饮食、饮水，于实验室适应性饲养1周后进行实验。大鼠乳腺癌MRMT-1 细胞购自美国ATCC 公司，于液氮中保存。

1.2 药物 益肾骨康方中药购自中国中医科学院望京医院门诊中药房，原方剂量120 g，大鼠和人的等效剂量按7 倍换算，成人的体质量设为60 kg。益肾骨康方高剂量组是成人常规剂量的2 倍，低剂量组为成人常规剂量的1/2 倍，再分别折算成大鼠的等效剂量。解毒化瘀组、扶正组分别为益肾骨康方原方根据方意拆方而来。中药提前浸泡30 min，放入锅中煎煮约1 h，浓缩，得到4 组中药生药终浓度。分别是益肾骨康方高剂量组：2.80 g/mL；益肾骨康方低剂量组：0.70 g/mL；解毒化瘀组：0.58 g/mL；扶正组：0.82 g/mL。

1.3 主要试剂与仪器 DMEM 高糖培养基（批号：C11995500BT）、胰酶溶液（批号：T1300）、胎牛血清（批号：11011-8611）、青霉素/链霉素混合液（批号：P1400），均购自北京索宝莱科技有限公司；Forma 370型细胞培养箱，美国Thermo 公司；Motic AE2000 型倒置光学显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；BME404型电子式机械测痛仪，天津伯尔尼科技有限公司。

1.4 骨转移癌大鼠模型建立 取雌性SD 大鼠，体质量为（200 ±20 ）g，用0.3%戊巴比妥钠，1 mL/100 g，腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后，固定于鼠板，右侧后肢剃毛，碘伏消毒，于胫骨内侧面胫骨平台下切开长度约1 cm 的切口，钝性分离肌肉，暴露骨面，用22 G 针头在胫骨平台下约0.5～1 cm 处钻孔，先垂直于骨面钻，然后再倾斜45°钻孔，待钻孔成功后，用10 uL 微量注射器抽取10 uL 大鼠乳腺癌MRMT-1 细胞悬液（1×107/mL）注入骨髓腔（对照组注射等量生理盐水），针头停留2 min，拔出后，迅速用骨蜡封孔。生理盐水冲洗溢出的肿瘤细胞，缝合，碘伏消毒，用红霉素软膏涂于创面。

1.5 分组与给药 将48 只大鼠按随机数表法分为益肾骨康方高剂量组、益肾骨康方低剂量组、扶正组、解毒化瘀组、对照组、模型组，每组8 只。除对照组外其余各组建立大鼠骨转移癌痛模型，于造模后第2天开始给药，各中药组大鼠给予对应的中药汤药，对照组和模型组给予生理盐水，均按1 mL/100 g进行灌胃，每日1 次，连续2 周。

1.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 25.0 进行数据分析处理，数值以均数±标准差（）表示，多个实验组均数之间比较采用单因素方差分析，以 α=0.05为检验水准，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 大鼠骨癌痛模型行为学观察

2.1 一般状态 造模后每日观察大鼠饮食、饮水、精神状态、创面愈合情况。于造模前、造模后第3、7、14 天测量体质量。

2.2 肿瘤体积 建模第15 天，引颈处死大鼠，剪下右后肢，并将后肢皮肤和肌肉组织剥离，暴露出带有转移肿瘤的胫骨，用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径。肿瘤体积=（肿瘤长径×肿瘤短径2）/ 2。

2.3 病理学评价

2.3.1 取材 建模第15 天，每组随机抽取3 只大鼠取右侧胫骨，将胫骨放于4%多聚甲醛中常温固定。使用EDTA 脱钙45 d，每3 日换1 次，EDTA 浓度为10%，pH 7.0～7.4，然后进行石蜡包埋、切片。

2.3.2 HE 染色 80°烤片1 h 后，将切片置于二甲苯中脱蜡3 次，每次10 min；分别于100%、95%乙醇中梯度脱水5 min，各2 次；流水冲洗2 min 后苏木素染色5 min；依次进行1%盐酸酒精溶液分化5～10s；自来水返蓝25 min；0.5%伊红染色2 min；95%、100%乙醇中梯度脱水5 min，各2 次；二甲苯中透明2 次，每次5 min，染色结束后委托北大三院病理科进行镜下观察。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量变化比较 对照组体质量从建模前到建模后第 14 天呈持续增长趋势；各建模组大鼠从建模后第7 天开始，体质量持续降低；与对照组比较，建模后第 7 天、第 14 天，各建模组大鼠体质量明显降低（P＜0.05）；建模后第14 天，扶正组（P=0.03）、低剂量组（P=0.023）体质量高于模型组，且有统计学差异，解毒化瘀组、高剂量组体质量均高于模型组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化比较（，n =8）g

表1 各组大鼠体质量变化比较（，n =8）g

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

3.2 肿瘤体积 由于对照组没有接种肿瘤细胞，所以肿瘤体积为（0.00±0.00），与模型组及各给药组比较均有统计学差异（P＜0.05），说明肿瘤接种成功。与模型组比较，各给药组平均肿瘤体积有减小趋势，但无统计学差异，可能与个体差异较大有关。见表2。

表2 各组大鼠肿瘤体积比较（，n =8）

表2 各组大鼠肿瘤体积比较（，n =8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05

3.3 病理学评价 对照组骨髓腔内未见肿瘤细胞浸润，骨皮质发育良好，骨皮质厚薄程度基本均一，骨小梁排列紧密。模型组骨组织被严重破坏，肿瘤细胞弥漫浸润骨髓腔，肿瘤细胞占骨组织的百分比约50%～60%，可见大片肿瘤性坏死，并向骨外侵袭，骨小梁受损及其明显，骨皮质破坏严重，出现骨皮质变薄。解毒组及扶正组骨髓腔内可见少量肿瘤细胞浸润，骨小梁轻微破坏或完整，骨皮质约0.5～0.6 μm，受损程度较模型组减轻。低剂量组及高剂量组骨皮质较完整，骨髓腔内可见肿瘤细胞灶状浸润，骨小梁受损较轻。见图1。

图1 各组大鼠胫骨图片（HE 染色，×20）

4 讨论

临床上骨转移癌常以自发性骨痛和局部压痛为首发症状，骨转移引起的疼痛是骨转移癌症患者较早出现、常见、难忍受的症状之一，常伴随功能障碍、病理性骨折等骨相关事件。目前临床上对于骨癌痛的治疗策略主要集中在放射治疗和阿片类药物，但阿片类药物会引起一些严重的不良反应，往往对治疗效果和患者的生活质量造成严重影响，临床仍需要积极寻找可持续替代的新药[10]。近年来，中医药丰富的治疗手段如汤剂内服、中药外敷、针灸、穴位注射等治疗取得了良好的临床疗效，起效快，且不良反应小，易被患者接受，在治疗癌性躯体痛方面具有明显优势[11-13]。

骨转移属中医学“骨瘤”“骨蚀”“骨瘘疮”“坏死”“骨痹”等范畴。明代《医学入门》云：“肾主骨，劳伤骨水，不能荣骨而为肿曰骨瘤。”清代《外科证治书》曰：“有骨瘤，骨生，甚痛。”中医理论研究疼痛有虚实两个方面，即“不通则痛”和“不荣则痛”，前者多因实性病理产物所致，后者多见于虚证。清代名医吴谦在《医宗金鉴·外科心法要诀·瘿瘤》曰：“骨瘤尤宜补肾散坚，行瘀利窍”。骨转移癌疼痛的病机为肾阴不足，不能养髓生骨，脾气不足，气血不能濡养筋脉导致“不荣则痛”，加之气滞、血瘀、痰凝、热毒、寒凝等阻碍气血运行形成“不通则痛”。益肾骨康方具 有补肾健脾，解毒化瘀，渗湿消肿，抗癌止痛的功效，适用于骨转移癌痛患者。

恶病质常见的病因是恶性肿瘤，严重影响患者生活质量，患者表现为进行性消瘦，体质量比原始体质量（诊断时）下降≥7.5%，或体质量指数＜80%，体质量是评价放化疗临床获益的重要指标之一。本研究发现，对照组大鼠体质量从建模前到建模后第 14 天呈持续增长趋势，而各建模组大鼠从建模后第7 天开始体质量持续降低，建模后第14 天，扶正组、低剂量组体质量下降不明显，扶正组拆方和低剂量组可缓解大鼠体质量进行性的下降。与模型组相比，各给药组平均肿瘤体积有减小趋势，说明各给药 组在一定程度上可抑制肿瘤的进展，但差异无统计学意义，可能与个体差异较大有关。

恶性肿瘤骨转移严重影响患者生活质量，预防和减少骨质破坏是其关键治疗手段。本研究中从大鼠胫骨病理组织学上可以看出，模型组骨组织被严重破坏，肿瘤细胞弥漫浸润骨髓腔，并向骨外侵袭，骨小梁受损明显，骨皮质破坏严重，出现骨皮质变薄。解毒组及扶正组骨髓腔内可见少量肿瘤细胞浸润，骨小梁轻微破坏或完整，骨皮质受损程度较模型组减轻。低剂量组及高剂量组骨皮质较完整，骨髓腔内可见肿瘤细胞灶状浸润，骨小梁受损较轻，其中解毒化瘀组和扶正组效果较明显，说明解毒化瘀类中药和扶正类中药联合运用能够协同发挥止痛和骨保护的作用。