纳米淡水珍珠粉对成骨细胞成骨活性的影响

廖 军 徐 普

珍珠由贝体外套膜中的珍珠囊分泌的珍珠质组成，其内部结构与人体骨类似，由95%～99%的结晶磷酸盐和1%～5%的有机基质组成，其中结晶磷酸盐的主要成分为文石型碳酸钙[1]。珍珠分海水珍珠和淡水珍珠，海水珍珠由文石及少量方解石、球文石组成，淡水珍珠则完全由文石组成。珍珠中高含量的钙离子可以促进钙盐沉积，抑制破骨细胞的骨吸收活性，促进骨再生，且其含有的水溶性蛋白具有骨诱导作用，能促进成骨细胞的分化[2,3]。同时，珍珠的纳米化可使钙离子及水溶性蛋白更易于释放，并减少珍珠的生物降解时间。本实验研究了纳米淡水珍珠粉(nanonized freshwater pearl powder，NFPP)相较于目前研究较成熟的纳米羟基磷灰石(nanonized hydroxyapatite，NAHA)对成骨细胞成骨活性的影响，为其在骨组织工程中的应用提供实验依据。

材料与方法

1.材料与试剂：微米级淡水珍珠粉(海南京润珍珠有限公司)，纳米羟基磷灰石(上海晶纯生化科技股份有限公司)，小鼠成骨细胞(江阴齐氏生物科技有限公司)，DMEM/F12(美国Gibco公司)，胎牛血清FBS(美国Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶溶液(美国Sigma公司)，细胞计数试剂盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ALP 酶联免疫吸附试剂盒(美国Rapidbio公司)，茜素红(北京索莱宝科技有限公司)。

2.仪器与设备：立式双轴纳米陶瓷砂磨分散机(深圳市科力纳米工程设备有限公司)，冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，Co-60γ辐照装置(北京原子高科金辉辐射技术应用有限公司)，CO2细胞培养箱(日本Sanyo公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，酶联免疫检测仪(美国Thermo Fisher公司)。

3.无菌NFPP的制备：将微米级淡水珍珠粉以立式双轴纳米陶瓷砂磨分散机研磨成纳米级，然后经冷冻干燥及60Co辐照灭菌制备成无菌NFPP。

4.实验分组：实验组为NFPP组，阳性对照组为NAHA组，阴性对照组为空白组。

5.成骨细胞培养：成骨细胞以D/F12培养基在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液，待细胞融合达80%～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。

6.细胞贴壁实验：实验分实验组及阳性对照组，按细胞密度5×104个/毫升接种至培养皿中，按实验分组将NFPP和NAHA各1ml缓慢加入培养皿中，使培养基刚好没过材料，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。待培养7h后，PBS冲洗3次，将培养皿中的实验材料冲洗干净，胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察，待细胞变圆、分离后加入D/F12培养基终止消化，混匀，吸取10μl细胞悬液及10μl台盼蓝混匀后做细胞计数。按下列公式计算细胞贴壁率：贴壁率(%)=[(接种细胞数-细胞计数)/接种细胞数]×100%。

7.CCK-8细胞增殖活性检测：按细胞密度1×104个/毫升接种于24孔培养板中，每孔1ml，按实验分组将NFPP和NAHA各200μl加入到细胞悬液中，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，隔天换液。分别在培养的第3、5、7天取24孔培养板检测，向各实验组中加入100μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育3.5h后每孔吸取100μl于96孔板中，酶标仪450nm处测定吸光度(A)值。

8.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定：细胞接种同前。分别在培养后的第3、5、7天取24孔培养板检测，向各实验组中加入400μl 1%Triton-100液，常温下裂解30min后将细胞悬液转移至1.5ml EP管中。将EP管置于冰上，超声波细胞破碎仪破碎5s，然后将EP管转移至低温高速离心机中，12000r/min、4℃离心30min。按小鼠ALP酶联免疫吸附试剂盒使用说明于波长450nm处测各孔的A值。

9.茜素红染色：按细胞密度1×104个/毫升接种至培养皿中，按实验分组将分别盛有NFPP和NAHA的细胞筛置入培养皿中，使培养基刚好没过材料，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，隔天换液。培养至第7天时行茜素红染色，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗3遍，2%茜素红溶液染色15min，蒸馏水冲洗3遍后倒置显微镜下拍照，以Image-Pro Plus 6.0行矿化面积测定。

结 果

1.细胞贴壁实验:实验组较阳性对照组中的细胞贴壁率高(36.04%±3.21% vs 27.38%±6.39%)，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.CCK-8细胞增殖活性检测：如表1、表2所示，各组中成骨细胞的数量随时间的推移而增加，且在各时间点细胞数量实验组高于阳性对照组高于阴性对照组。培养第3天时，实验组与阴性对照组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。培养第5天时，实验组与两个对照组间比较，差异均有统计学意义

表1 CCK-8实验各组各时间点所测A值的比较

表2 CCK-8各时间段A值两两比较P值

3.ALP活性测定:各组中ALP活性随时间的推移而增加，且在各时间点ALP活性实验组高于阳性对照组高于阴性对照组。培养第3天、5天时，实验组与两个对照组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，两个对照组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。培养第7天时，各实验组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表3、表4。

表3 ALP活性检测各组各时间点所测A的比较

表4 ALP活性检测各时间段A值两两比较P值

4.茜素红染色:细胞汇合呈集落生长，细胞间红褐色结节面积实验组(45.79%)大于阳性对照组(40.74%)大于阴性对照组(15.54%)，详见图1。

图1 钙结节茜素红染色(×400)

讨 论

自1992年法国科学家Lopezt等[4]发现珍珠质层具有诱导成骨作用以来，陆续有研究表明珍珠层具有良好的生物相容性，骨诱导及骨传导作用。而珍珠层中的蛋白在促进成骨细胞分化及组织矿化中起着重要作用。珍珠与贝壳珍珠层均由珍珠囊分泌的珍珠质组成，两者成分和结构非常相似，均由高于95%的矿物质和低于5%的有机基质组成，但珍珠中的有机质含量和蛋白质含量均较贝壳珍珠层中的高，故研究者开始研究珍珠的成骨作用。

研究证实，珍珠粉能促进成骨细胞的增殖、分化及钙结节的形成，并抑制成骨细胞的凋亡[5]。与微米级比较，纳米级具有更好的生物降解性及促骨组织再生作用[6,7]。但与目前研究较成熟的NAHA比较，NFPP促成骨作用如何尚缺少报道。本实验通过对比NFPP与NAHA对成骨细胞成骨活性的影响，研究其在骨组织工程中的应用价值。

在骨组织缺损的修复过程中，成骨相关细胞在骨缺损区的定植黏附至关重要[8]。本研究中实验组中细胞贴壁率高于阳性对照组，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。因考虑NFPP及NAHA为纳米级粉末状，其材料本身无定型且无特定孔隙，而研究表明珍珠粉中含有的有机蛋白具有骨诱导作用，可诱导成骨相关细胞的聚集并促进成骨细胞的分化，实验所得材料对细胞贴壁的影响考虑主要为有机蛋白的作用；但材料本身的三维结构及孔隙率也影响着骨缺损区骨组织再生[9]。当骨移植材料植入骨缺损区后，有两种成骨方式，即接触成骨与距离成骨。接触成骨较距离成骨成骨速度快，在早期骨再生中起着重要作用。在接触成骨中，成骨细胞黏附是植入材料与成骨细胞接触的第一步，直接影响成骨细胞在骨移植材料表面的增殖及分化。研究所得两组间细胞贴壁率差异无统计学意义的可能因素之一为材料不具有特定孔隙率的三维支架结构，后续研究中需将NFPP制备成具有稳定三维结构的骨移植材料进一步测定其对细胞定制黏附的影响。

当成骨相关细胞在骨缺损区迁移定植后，进一步增殖分化并分泌细胞外基质参与组织矿化。本研究结果表明，NFPP和NAHA均能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化结节形成，且NFPP较NAHA能更显著地促进成骨细胞的增殖、分化。成骨细胞是骨生成的主要细胞，能分泌多种成骨相关蛋白，包括骨桥蛋白、胶原蛋白、转化生长因子及ALP等，促进细胞外基质的合成及矿化[10,11]。如骨桥蛋白能促进磷酸钙的沉积及调控羟基磷灰石晶体的大小和形态[12,13]。胶原蛋白能促进细胞黏附，为营养物质、氧和具有机械传导作用的分子提供良好的组织通透性[14,15]。转化生长因子能促进未分化间充质干细胞向成骨细胞分化[16]。其中ALP是成骨细胞早期分化的特异性标志物，其分泌量随成骨细胞的分化而增加[17]。

ALP能水解磷酸酯键，释放无机磷，增加局部组织中磷酸根的浓度从而促进磷酸钙的沉积并延续钙化过程，是细胞外基质矿化启动所必须的，而矿化结节的形成标志着成骨细胞的分化成熟，是成骨细胞功能表达的主要形态学表现[18,19]。骨缺损的修复是成骨相关细胞如间充质干细胞、成骨细胞等定植、增殖、分化及矿化的一系列有机连续的整体过程。局部组织中成骨细胞增殖数及分化程度越好，其分泌的成骨相关蛋白及ALP表达越高，则越有利于骨组织再生。本研究中NFPP可促进小鼠成骨细胞的增殖、分化及矿化，与骨缺损修复过程基本一致，表明NFPP可能在生物体内调控骨组织再生并起促进作用。

综上所述，NFPP较NAHA能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化结节的形成。但目前实验尚未在蛋白及基因层面检测对比研究，且人体是一个复杂的有机整体，骨移植材料对骨再生的影响还可能通过机体的局部环境和宏观网络来调控。同时，对于骨移植材料，如能具有一定孔隙率及孔隙大小的三维空间结构则更有利于新生骨组织的爬行替及新生血管的长入，为骨组织的血管化提供足够的空间，并为骨组织再生所需空间起到维持作用。故后续研究中可进一步研究NFPP对成骨细胞相关蛋白及成骨基因表达的影响，并可将NFPP复合成具有适当孔隙率的三维空间结构的骨移植材料，在动物体内进一步验证其成骨作用。