拓扑异构酶Ⅱ在81例脑胶质瘤中的表达及意义

阴鲁鑫 徐伟文 许 儒 张 奇 陈 洋

神经胶质瘤是一种起源于神经胶质细胞的颅内肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。全球每年有近10万名新诊断患者[1]。WHO将胶质瘤分为4级，4级又称胶质母细胞瘤，是人类所有类型肿瘤中预后最差的一种。其高致残率和病死率严重影响人们的生活质量，威胁人们的生命[2]。在诊断出恶性胶质瘤的成年人中，超过2/3的人在诊断后2年内死亡[3]。目前人脑胶质瘤采用的是手术切除、辅助放化疗和免疫治疗的综合方法[4,5]。由于易侵犯相邻组织，瘤体常与邻近组织界限不清，全切难度高，易再发等特点，脑恶性肿瘤的治疗始终是人类医学史上的一个重大挑战。因此基因检测与治疗成为当今世界研究胶质瘤的热门话题。研究表明拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)作为肿瘤标志物，与胶质瘤发生、发展密切相关，提示其表达与恶性程度与预后相关[6]。本研究采取回顾性分析，研究拓扑异构酶Ⅱ在不同级别脑胶质瘤中的表达及相关性，分析其与胶质瘤临床病理因素的相关性，并探讨TOPⅡ在胶质瘤中的临床价值。

材料与方法

1.材料:收集2015年10月～2017年12月徐州医科大学附属医院脑外科胶质瘤标本81例，其标本结果已经由病理科证明。标本均为第1次在笔者医院行手术取得。标本中男性患者44例，女性患者37例，患者年龄11～74岁，平均年龄为52.65±13.11岁。低恶度胶质瘤(WHOⅡ级)28例(34.57%)，包括少突胶质细胞瘤9例、星形细胞瘤19例；高恶度胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)53例(65.43%)，包含间变性星形细胞瘤16例、胶质母细胞瘤37例。

2.试剂与方法：即用型鼠抗人TOPⅡ单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB显色剂、EDTA pH 8.0修复液、PBS缓冲液、二抗均购自罗氏诊断产品上海有限公司。标本常规10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别行HE及免疫组化Envision法染色，染色步骤按步骤说明书严格进行。PBS代替一抗做阴性对照。

3.免疫组化评判标准：结果由两位有经验的病理医师阅片后，取得一致意见得出，且所有指标只看肿瘤细胞，以肿瘤周围正常脑组织为内对照。免疫组化染色结果以细胞膜、质、核中分别存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性。TOPⅡ阳性为核表达，每张切片计数所有TOPⅡ阳性细胞数/肿瘤细胞总数，为TOPⅡ的百分比，采用染色判定标准：阳性肿瘤细胞数≥5%为表达“+”。

4.统计学方法：应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析，采用χ2检验分析TOPⅡ在不同级别脑胶质瘤中表达差异，TOPⅡ与不同分级胶质瘤的关联性用Spearman等级相关分析法检验，χ2检验探讨TOPⅡ表达与临床特征之间的关系，影响胶质瘤预后因素用COX回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TOPⅡ在81例不同病理分级胶质瘤中的分布：TOPⅡ在胶质瘤组织中染色定位主要于细胞核(图1)，81例胶质瘤标本中表达阳性有56例，其表达率占69.14%。在选取的81例脑胶质瘤标本中，TOPⅡ表达阳性在病理级别Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级所占比例分别为25.00%、87.50%和94.59%，其表达阳性率随着肿瘤病理级别的增高呈现出上升的趋势,χ2检验分析，TOPⅡ在Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明TOPⅡ表达与胶质瘤分级有关。经χ2检验分析，TOPⅡ表达在胶质瘤病理级别Ⅱ和Ⅲ级、Ⅱ和Ⅳ级之间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)，详见表1。

图1 TOPⅡ在胶质瘤中表达(Envision法，×400)

表1 TOPⅡ表达与81例脑胶质瘤患者各项临床因素的比较[n(%)]

2.TOPⅡ表达与81例不同病理分级胶质瘤的关联性：采用Spearman秩相关分析法分析TOPⅡ表达与不同病理分级胶质瘤的相关性，TOPⅡ表达在81例不同病理分级肿瘤中呈正相关(r=0.644，P=0.000)。

3.TOPⅡ表达与81例脑胶质瘤临床病理特征的相关性：TOPⅡ表达与各项临床因素之间的关系，按照年龄、性别、病理分级、高低病理级别、术前KPS评分、IDH1表达，进行分组分析，分析结果详见表1，在所选的81例脑胶质瘤患者，年龄>45岁的TOPⅡ阳性表达率为81.36%，年龄≤45岁阳性表达率为36.36%；男性患者中阳性表达率为72.73%，女性患者中阳性表达率为64.86%；其中28例低级别胶质瘤患者中TOPⅡ阳性表达7例(25%)，53例高级别胶质瘤患者中阳性表达49例(92.45%)；62例术前KPS评分≥80分患者中TOPⅡ阳性表达37例(59.68%)，19例术前KPS评分<80分患者中阳性表达19例(100%)；30例IDH1表达阳性患者中TOPⅡ阳性表达10例(33.33%)，51例IDH1表达阴性患者中TOPⅡ阳性表达46例(90.20%)，经χ2检验分析表明，年龄>45岁、高病理分级、术前KPS评分<80分、IDH1阴性表达者中TOPⅡ阳性表达率分别高于年龄≤45岁、低病理分级、术前KPS评分≥80分、IDH1阳性表达者(P<0.05)，而性别比较差异无统计学意义(P=0.445)。

4.81例脑胶质瘤预后影响因素的COX回归分析：患者出院后，每隔5个月对患者或其家属进行定期随访，随访截止时间为2020年8月。依据年龄、性别、病理级别高低、术前KPS评分、术后是否行辅助治疗、TOPⅡ表达、IDH1表达分组，结果显示，病理级别、术前KPS评分、术后辅助治疗、TOPⅡ表达和IDH1表达对81例胶质瘤患者术后生存期限影响较大(P<0.05)，而年龄、性别对术后生存期影响较小(P>0.05)，详见表2。

表2 影响81例胶质瘤术后生存期的COX回顾分析

讨 论

胶质瘤是最常见的脑肿瘤类型，恶性胶质瘤具有极高的致死性，患者的5年生存率不到10%[7]。胶质瘤包括源于星形胶质细胞、室管膜细胞和少突胶质细胞或脉络丛的肿瘤，其中星形细胞瘤是最常见的。星形细胞瘤，起源于星形细胞，可以是局限性或弥漫性的。局限性星形细胞瘤包括毛细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和室管膜下巨细胞星形细胞瘤。弥漫性星形细胞瘤包括低级纤维星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑胶质瘤病和多形性胶质母细胞瘤[8]。胶质瘤是成人脑肿瘤中预后较差的一种[9]。脑胶质瘤也是所有儿科实体瘤中最常见和最致命的。迄今为止，脑部恶性肿瘤的治疗始终是人类医学史上的一个重大挑战，这在很大程度上是由于这些癌症的生物学特性导致的。然而，脑胶质瘤的发生、进展、具体侵袭机制尚不是完全清楚。但有研究发现，胶质瘤的发生、进展是一个极其繁杂的经过，涉及多种途径及因素，其中包含多个细胞因子及癌症基因的共同作用，其中一些具有诊断及影响预后的作用[10]。近年来，随着分子生物学、分子遗传学的发展及分子诊断、免疫组化等技术的兴起，有关肿瘤增殖、诊断和预后的分子标志物逐渐被发现，如拓扑异构酶Ⅱ等。

拓扑异构酶是种同源二聚体蛋白，在复制、转录、重组、修复和染色质重塑过程中调节DNA螺旋的上旋或下旋[11,12]。这些酶通过提供短暂的DNA断裂来执行拓扑转换，通过该断裂可以解决由于DNA螺旋的展开和重绕而导致的DNA纠缠的独特问题[13]。根据它们是否在DNA中造成瞬时单链或双链断裂，分为Ⅰ和Ⅱ两类[14]。目前TOPⅡ在人体细胞内是普遍存在的酶，在许多基本的DNA过程中发挥重要作用。它们通过在双螺旋的糖磷酸主链上产生短暂的断裂来消除遗传物质中的结和缠结。由于Ⅱ型拓扑异构酶在其催化循环中产生DNA链断裂是必不可少的，所以它们在每次起作用时都有可能产生基因组断裂。因此，这些酶对增殖细胞的生存至关重要。

根据研究报道，TOPⅡ在胶质瘤中呈高表达，不同病理级别脑胶质瘤细胞中表达阳性率不同,随着病理级别的升高而升高[15]。研究表明，TOPⅡ表达与男女性别因素无关，与高低病理分级有关，在高病理分级脑癌中的表达要显著高于低病理分级的脑癌，同时认为TOPⅡ可作为人脑胶质瘤的增殖指数[16]。通过检测TOPⅡ在脑胶质瘤细胞中的表达情况发现，TOPⅡ的表达与脑癌病理分级有关，提示TOPⅡ能作为评价胶质瘤生存的相关指标[6]。本研究结果表明，男女性别差异对TOPⅡ表达影响较小，年龄、病理分级和术前KPS评分对TOPⅡ表达影响较大；TOPⅡ在胶质瘤组织中阳性表达率为69.14%，在病理级别Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级所占比例分别为25.00%、87.50%和94.59%，其表达强度随着肿瘤恶性程度的升高而升高，在低度与高度恶性组之间的表达水平也有较大差异；TOPⅡ表达与肿瘤恶性程度呈正相关，且与胶质瘤预后有关，可见TOPⅡ与胶质瘤患者病情及预后呈正相关，提示TOPⅡ表达可能通过某种未知的机制促使胶质瘤进一步恶性转化，同时可作为评价胶质瘤恶性程度及预后的重要指标之一。

分析TOPⅡ表达预后不良的原因，可能与细胞增殖活化有关。通常来说，肿瘤增殖活化与生存有着紧密联系，增生能力越强，其病理分级越高，生存期也越短。TOPⅡ是DNA复制、转录和细胞生长必需的，在增殖迅速的肿瘤中活性升高，提示其与肿瘤的增殖能力有关。研究显示，TOPⅡ在细胞周期的S期、G2期、M期、部分G0期和G1期均有表达，且与Ki-67表达有较高的关联性，Ki-67作为一种增殖抗原，具有体现肿瘤增殖潜能水平的能力，故认为TOPⅡ可作为人脑胶质瘤的增殖指数[17]。此外，有研究指出，TOPⅡ家族通过调节靶基因和参与能量代谢介导肿瘤细胞缺氧耐受而促进靶基因蛋白survivin表达，进而提高肿瘤侵袭性[18]。这与本研究结果大致相符，然而具体机制尚需开展深入的基础研究予以证实。

综上所述，TOPⅡ在胶质瘤中呈高表达，在不同级别胶质瘤中分布不同，提示与病理分级及预后相关，且TOPⅡ表达与年龄、病理级别、术前KPS评分和IDH1表达有关，因此，临床可通过检测TOPⅡ的表达，实现对胶质瘤患者病情严重程度及预后的评估。