零乳糖乳酸菌发酵菌种的筛选及应用研究

李理，余腾斐，周晴晴，柯雪琴，朱珺，林国栋，李言郡，陈苏

（杭州娃哈哈集团有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司 浙江省食品生物工程重点实验室，杭州 310018）

0 引言

酸奶和风味发酵乳是目前乳制品市场的宠儿，因其具有良好的口感、风味同时兼具一定促进健康的作用，越来越受到消费者接受和喜爱。与纯奶相比，酸奶由于经过发酵，其中20%～30%的乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖[1]，但是大多数市售的酸奶和风味发酵乳中仍然有2.5～3.0 g/100g的乳糖，这样的含量对于乳糖不耐人群仍然有较大风险。

我国约有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐症”，长期危害在儿童中易表现为钙吸收不良、腹泻、体重低下及生长发育迟缓，在老年人尤其是中老年妇女中易表现为骨质疏松症状[2]。低乳糖或无乳糖的乳制品是解决乳糖不耐受，增加乳品消费的最佳解决方案。近几年来，我国市场上涌现出了低或无乳糖的牛奶、酸奶都获得了极大的成功。这些产品每年的销量都以两位数的速度增长，为企业带来了良好的效益[1-3]。目前生产低或无乳糖乳制品多数采用乳糖酶水解技术，但该技术的设备和维护成本较高。与酶水解技术相比，快速且大量消耗乳糖的发酵菌种具有技术门槛低、生产成本少等优势。Kim等人[4]通过多级筛选获得了自发突变的乳酸菌菌株，并通过菌株组合发酵获得低乳糖和零乳糖的发酵乳。

本研究从我国西藏地区采集的传统发酵乳制品中分离并筛选获得一株能够快速且大量消耗乳糖的德式乳杆菌保加利亚菌株。该菌株发酵所获得的发酵乳中乳糖含量达到了《GB28050-2011食品安全国家标准-预包装食品营养标签通则》中低乳糖和零乳糖的含量要求并可形成良好的感官品质，是生产低/零乳糖发酵乳制品的理想菌株资源。特色发酵菌种的应用为低乳糖或零乳糖发酵乳制品的生产提供了新的技术路线，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

130份传统发酵乳制品，采集自我国西藏地区牧民自制发酵乳制品；MRS肉汤，广东环凯微生物科技有限公司；M 17肉汤，青岛海博生物技术有限公司；脱脂乳粉、浓缩乳清蛋白，恒天然（中国）有限公司；牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸出粉，安琪酵母股份有限公司；乳糖标准品，Sigma生物试剂有限公司；乙腈（色谱纯），默克试剂；乳糖、精氨酸、半胱氨酸、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸二胺等，国产分析纯试剂；番茄汁，自制。MRS、M 17固体培养基在肉汤中添加1.8%的技术琼脂，MRS培养基用于乳酸杆菌的培养，M 17培养基用于乳酸球菌的培养。

恒温培养箱，德国赛默飞世尔科技公司；MiniforsBacteria实验室台式标准发酵罐，伊孚森生物技术（中国）有限公司；OptimaTMXPN超速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；Christ真空冷冻干燥机，北京博励有限公司；1200液相色谱系统，安捷伦（中国）科技有限公司；Delta320p H计，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

使用一次性无菌吸管和勺子取适量自制发酵乳制品，迅速放入已灭菌的容器内，密封并标号，放入低温保温箱中。采集后样品于4℃冰箱保存备用。样品采集信息表见表1。

表1 采集样品信息统计表

1.2.2 乳酸菌的分离、纯化与保藏

无菌操作：1 mL或1 g样品完全溶解于灭菌的生理盐水中并进行梯度稀释。经稀释的样品分别涂布于MRS和M 17固体培养基中，37℃培养48～72 h。观察并记录菌落特征。

从平板上挑取具有典型乳酸菌特征的单菌落进行革兰氏染色，将G+菌株继续划线于MRS和M 17固体培养基，直至确定为纯培养物。将纯化的菌株再次进行革兰氏染色并做H2O2酶试验。

纯培养物分别接种于对应的液体培养基中，37℃培养12～24 h，连续传代培养2次，获得的菌悬液加甘油作为保护剂，置于-80℃冰箱冷冻保存。

1.2.3 乳酸菌的鉴定

取2 mL菌悬液至无菌EP管中后密封，冷藏寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA测序鉴定。

1.2.4 乳酸菌发酵性能筛选

产酸性能测试。经两次传代的菌悬液用培养基调整OD600至0.8，按2%（v/v）接种于100 m L灭菌复原脱脂乳中，37℃发酵12 h。冷却至室温，按照GB5413.34中方法检测发酵乳中的总酸含量（以乳酸计）。

感官评价。发酵乳冷却至室温后，按表2中的评价指标及评分标准，由10名乳品研发人员（5男5女）对各发酵乳的风味、口感、组织状态、色泽进行评价打分。每组10份样品，评价完成后休息15 min再进行下一组。

表2 感官评价指标及评价标准[5]

1.2.5 发酵乳中乳糖含量的检测

经两次传代的菌悬液用培养基调整OD600至0.8，按2%（v/v）接种于100 m L灭菌复原脱脂乳中，37℃发酵12 h制备发酵乳，并按下述方法检测其中乳糖含量。样品前处理：准确称取样品1.00 g加入等质量无水乙醇，震荡30 s后，12 000 rmp低温离心10 min，取适量上清，0.22μm滤膜过滤，-20℃备用。色谱条件：液相色谱仪，Agilent 1200，色谱柱，Hypersil NH 2（4.6 mm×300 mm，5μm），流动相，乙腈∶水=75∶25，流速，1.4 mL/min，检测器，示差折光检测器，洗脱时间，20 min，柱温：30℃。标准曲线的制作：将乳糖标准品配置成50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的梯度浓度溶液，按照上述方法与色谱条件进行测定。以标准品的浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.6 菌株高密度培养工艺优化

1.2.6.1 碳源优化

以乳糖为单一碳源，添加量分别为20、25、30、40、50 g/L，其他营养成分同MRS肉汤。经两次传代的菌悬液按1%（v/v）接种于不同乳糖含量的培养基中，37℃发酵9.5 h，测定发酵液OD600和活菌数，确定乳糖的最佳添加量。

1.2.6.2 氮源优化

前期氮源筛选实验结果显示，牛肉浸出粉、胰蛋白胨、牛骨蛋白胨对目标菌株的生长有明显的促进作用，因此对这3种氮源的添加量进行单因素优化。

培养基中添加30 g/L乳糖和10 g/L胰蛋白胨，牛肉浸出粉分别添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他营养成分同MRS肉汤。

培养基中添加30 g/L乳糖和10 g/L牛肉浸出粉，胰蛋白胨分别添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他营养成分同MRS肉汤。

培养基中添加30 g/L乳糖、10 g/L牛肉浸出粉和15 g/L胰蛋白胨，牛骨蛋白胨分别添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他营养成分同MRS肉汤。

经两次传代的菌悬液按1%（v/v）接种于不同氮源含量的培养基中，37℃发酵9.5 h，测定发酵液OD600和活菌数，确定复合氮源的最佳添加量。

1.2.6.3 生长因子优化

前期生长因子筛选实验结果显示，番茄汁和精氨酸对目标菌株的生长有明显的促进作用，因此对这两种生长因子的添加量进行单因素优化。

碳源和氮源按优化结果添加，番茄汁分别添加0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 g/L，其他营养成分同MRS肉汤。

碳源和氮源按优化结果添加，番茄汁添加1.5 g/L，精氨酸分别0.02、0.05、0.08、0.10、0.15 g/L，添加其他营养成分同MRS肉汤。

经两次传代的菌悬液按1%（v/v）接种于不同生长因子的培养基中，37℃发酵9.5 h，测定发酵液OD600和活菌数，确定生长因子的最佳添加量。

1.2.6.4 发酵恒定p H值优化

以优化结果配置发酵培养基，发酵过程中p H值分别控制为4.8、5.0、5.2、5.5、6.0，用氨水进行调节。经两次传代的菌悬液按1%（v/v）接种于培养基中，37℃发酵9.5 h，测定发酵液OD600和活菌数，确定最佳的发酵恒定p H值。

1.2.6.5 发酵恒定温度优化

以优化结果配置发酵培养基，发酵温度分别控制为30、37、40、43℃，p H值控制为优化结果。经两次传代的菌悬液按1%（v/v）接种于培养基中发酵9.5 h，测定发酵液OD600和活菌数，确定最佳的发酵恒定温度。

1.2.7 低/零乳糖发酵乳的制备

以菌株WHH 3887的冻干菌粉为直投式发酵剂，发酵基料为复原的脱脂乳，并添加适量的浓缩乳清蛋白，调整蛋白含量值≥2.9 g/100g，乳糖含量为3.22 g/100g。基料经过剪切、均质、分装、巴氏杀菌处理后，冷却至40℃左右，称取适量冻干菌粉无菌操作接入基料中，混匀后至于40℃恒温发酵10 h和24 h。破乳终止发酵，检测各发酵乳的p H值、酸度、活菌数、乳糖含量，并进行感官评价，以市售冷链酸奶为对照。

1.2.8 统计分析

测定指标均表示为3次实验的平均值±标准偏差。显著性分析采用软件SPSS 17.0中的Duncan’s多重比较检验法进行，显著水平设置为0.05。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌的分离、鉴定

从130份传统发酵乳制品中共计分离等到392株菌。经革兰氏染色鉴定、H2O2酶试验和16S rDNA序列测序后得到387株乳酸菌和5株酵母菌。乳酸菌菌株光学显微镜下观察分别呈现球状、链球状和杆状。部分分离菌株经革兰氏染色后，在显微镜下观察的细胞形态如图1所示。

图1 乳酸菌分离株革兰氏染色显微镜下细胞形态

2.2 乳酸菌的发酵性能筛选

乳酸菌发酵时可以利用乳糖经糖酵解途径产生乳酸，乳酸菌产酸能力与菌体细胞内β-半乳糖苷没的量相关[6]。因此可以根据产生乳酸的多少间接衡量菌株对乳糖的利用情况。对387株乳酸菌在复原脱脂乳发酵12 h后的总酸含量进行测定，同时对发酵乳的感官品质进行评价打分。结果显示，387株乳酸菌中有26株乳酸菌发酵后所得发酵乳的总酸含量≥10.0 g/L（以乳酸计）且感官评价打分高于80分，说明这些菌株对乳糖的利用较好，同时能够形成良好的发酵乳质构和风味，结果表3所示。

表3 发酵性能较优的乳酸菌发酵乳的酸度及感官评价

（续表3）

2.3 乳酸菌消耗乳糖的能力筛选

对初筛得到的26株乳酸菌37℃发酵复原脱脂乳12 h后所得发酵乳中的乳糖含量进行检测，结果如表4所示。

表4 26株乳酸菌发酵乳中乳糖含量

由表4可以看出，菌株WHH 3887经发酵后乳糖残留量最低，仅为1.41±0.02 g/100g，达到了GB28050-2011中对低乳糖乳制品中乳糖含量的限制要求。伍桃英[7]采用不同型号的乳糖酶水解乳糖制备低乳糖乳品中乳糖的含量为0.696 g/100g，该结果说明菌株WHH 3887作为生产低乳糖的发酵乳制品是非常有潜力的。

2.4 菌株WHH3887的高密度发酵工艺优化

2.4.1 碳源、氮源优化

培养基中的碳源、氮源种类和添加量是影响菌株生长的重要因素，同时有研究报道指出[2]，乳糖酶作为一种诱导酶，底物的存在会诱导其表达。以乳糖作为菌株3887发酵的单一碳源，考察不同添加量对其生长的影响，结果如图2(a)所示。当乳糖为单一碳源时，随添加量逐渐增加，菌株WHH 3887菌悬液的OD值和活菌数呈现先增加后下降的趋势，当添加量为30 g/L，OD值和活菌数均达到最高，且显著高于其他添加浓度（P＜0.05），因此，后续优化实验乳糖的添加量为30 g/L。

以单因素实验考察菌株WHH 3887高密度发酵的最佳复合氮源，结果如图2(b)～2(d)所示。牛肉浸出粉的添加量为10 g/L和15 g/L时，菌悬液的OD值和活菌数较高，差别不显著（P=0.083），继续增加反而下降。胰蛋白胨和牛骨蛋白对影响菌体生长情况与牛肉浸出粉的影响相似，添加量分别为为15 g/L和20 g/L时，菌株的生长最好，且显著优于其他添加浓度（P＜0.05）。综合优化结果和生产成本，菌株WHH 3887高密度发酵的复合氮源为牛肉浸出粉10 g/L、胰蛋白胨15 g/L、牛骨蛋白胨为20 g/L。经过碳源和氮源的优化后，发酵液活菌数达到了8.9×108CFU/m L，较优化前提高了4.63倍。

图2 菌株WHH3887碳源、氮源添加量优化

2.4.2 生长因子优化

经过碳源和氮源的优化，菌株WHH 3887的生长有所改善。根据前期生长因子的筛选结果，对番茄汁和精氨酸的添加量进行优化，并发现添加番茄汁1.5 g/L和精氨酸0.1g/L的效果最优图3(a)和3(b)。李佳[8]的研究指出，1%的番茄汁对保加利亚乳杆菌LB5的生长有明显的促进作用；侯聚敏[9]也指出番茄汁可以促进乳酸菌的增殖。

图3 菌株WHH3887生长因子优化

2.4.3 恒定p H值、培养温度优化

研究结果发现，菌株WHH 3887在培养时控制p H和不控制p H值的生长情况差别显著，这是由于乳杆菌在培养过程中大量产酸，从而会对菌体的生长产生抑制。本研究中，不控制pH值时，发酵液活菌数仅为7.35×108CFU/mL，p H值控制为5.5时，发酵液活菌数显著提高到1.37×109CFU/mL（图4a）。黄良昌等[10]通过研究发现了控制p H值为5.8时，培养的保加利亚乳杆菌发酵液活菌数也较未控制p H值时有显著的提高。

保加利亚乳杆菌属于嗜温乳酸菌，优化温度范围选择30～43℃，结果发现，30℃和43℃时菌株的生长明显受到抑制，40℃最佳且差异极显著（P≤0.01），活菌数最高达到1.89×109CFU/mL（图4b）。

图4 不同pH值和培养温度对菌株3887生长的影响

经过碳源、氮源、生长因子、发酵条件等一系列关键工艺条件的优化，菌株WHH 3887的发酵液活菌数由初始的1.92×108CFU/mL提高到了1.89×109CFU，培养优化效果显著。

2.5 低/零乳糖发酵乳制备及稳定性跟踪

按照优化工艺对菌株WHH 3887进行高密度培养并制备冻干菌粉，作为发酵剂使用。分别发酵10 h和24 h后终止发酵，得到的发酵乳10℃后熟12 h，进行测试，结果如表5所示。

由表5中结果可以发现，使用菌株WHH 3887制备的发酵乳在pH值、酸度、活菌数和感官评分方面的指标与3份市售发酵乳基本一致，其中使用菌株WHH 3887自制的发酵乳比市售酸奶的活菌数高，但发酵24 h后的酸度明显偏高，从而影响了口感，导致感官评分较低。乳糖含量方面，3份市售酸奶的乳糖含量均在3%左右，而采用菌株WHH 3887制备的发酵乳，发酵10 h后，乳糖含量为1.83 g/100 g，达到了国标GB28050-2011中低乳糖含量的宣称，继续发酵24 h，乳糖含量进一步下降至0.44 g/100 g，达到了国标GB28050-2011《食品安全国家标准-预包装食品营养标签通则》中零乳糖含量的宣称。

表5 不同发酵乳样品测试指标

3 结论

本研究经过发酵性能初筛和乳糖消耗能力复筛，获得一株能够良好发酵牛乳同时大量消耗乳糖的乳酸菌，经过鉴定该菌株为德式乳杆菌保加利亚亚种，并命名为WHH 3887。经过碳源、氮源、生长因子及培养条件的优化，菌株3887的活菌数显著提高，经优化后发酵液的活菌数可达到1.89×109CFU/mL，经冷冻干燥后菌粉的活菌数达到了1.93×1011CFU/g。以冻干粉为直投式发酵剂制备的发酵乳，发酵10 h后乳糖含量为1.83 g/100 g，发酵24 h后乳糖含量为0.44 g/100 g，分别达到了国标GB28050-2011《食品安全国家标准-预包装食品营养标签通则》中零乳糖含量的宣称。同时，发酵乳在PH值、酸度、活菌数和感官品质方面与市售的冷链酸奶基本一致，说明该菌株是生产低乳糖或零乳糖发酵乳制品的理想发酵菌种。后期研究可将菌株WHH 3887与嗜热链球菌或乳酸乳球菌进行复配发酵，以改善零乳糖发酵乳酸度较高的问题，提升特色发酵剂菌株的产业化应用。