姜黄素对阿尔茨海默病模型大鼠海马区GSK3β蛋白表达的影响

俞柏翎 叶茂盛 潘 锋 周 勇 郦旦明

近年来随着社会的不断发展进步及生活质量的不断提高，老年人口与日俱增，对老年疾病的诊疗成为社会关注的热点话题之一。阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以慢性、进行性记忆功能受损、认知功能紊乱及行为改变为特点，占所有痴呆的2/3以上，其发生率逐年上升，严重程度随着年龄增长而加剧，已是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病之一[1]。至今，尚无有效手段能逆转或阻止AD疾病进展，因此寻求能减缓甚至阻断病情发展的药物具有重要意义。

姜黄素是一种多酚类色素，因其具有多种生物活性，能发挥多靶点治疗作用，已被广泛应用于实验研究。近年来研究发现，姜黄素能改善AD模型动物的认知功能，发挥抑制Aβ肽的生成和沉积、清除自由基、减轻神经炎性反应等作用[2]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过多种信号转导途径调控Aβ生成、tau蛋白磷酸化及细胞凋亡等参与了AD的病理生理过程。本实验拟比较不同剂量的姜黄素对AD模型大鼠学习记忆及海马区神经细胞的影响，探讨姜黄素对AD模型大鼠海马区GSK3β蛋白表达的影响。

材料与方法

1.实验材料：姜黄素(CAS号：458-37-7，批号：15051512，纯度>98%)购自上海远慕生物工程公司；Aβ1-42Antibody Blocking Peptide(Aβ1-42)(批号：05186048，编号bs-0107p)购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗GSK-3β(货号：12456S)购自美国CST公司，β-actin(货号：4970S)购自美国CST公司，注射用青霉素钠购自哈药集团制药总厂；DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；实验所需相关仪器包括图像分析系统、鼠脑立体定位、Morris水迷宫系统等由浙江中医药大学实验室提供。

2.动物选择及分组：清洁级SD雄性大鼠60只，体质量为180～220g，由浙江中医药大学动物实验室提供，动物实验条件合格证：SYXK(浙)2013-0184。本实验由浙江中医药大学医学伦理学委员会审批后进行。经过1周的适应性喂养后，按照数字表法随机分为4组，即假手术组、Aβ模型组、低剂量姜黄素干预组(L-CU组)和高剂量姜黄素干预组(H-CU组)。

3.模型建立及给药：Aβ1-42(浓度为10g/L)溶于无菌PBS(pH=7.4)，37℃下储存孵育1周。大鼠经10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,将大鼠头固定于脑立体定位仪，常规备皮消毒，颅顶部正中切开皮肤，暴露前囟，选择大鼠右侧海马CA1区作为注射靶区，定位点参照《大鼠脑立体定位图谱》，选择前囟后3.0mm，右侧旁开2.2mm[3]。微量注射器对准靶点，缓慢进针，深度为2.5～3.0mm，假手术组注射灭菌生理盐水1μl，模型组和干预组注射Aβ1-42溶液1μl，为使注射液能充分弥散，留针5min后退针，常规消毒缝合切口，术后3天予青霉素肌内注射防止感染。术后正常饲养30天，假手术组、模型组给予0.9%NaCl溶液灌胃，L-CU组给予150mg/kg剂量姜黄素灌胃，H-CU组给予300mg/kg剂量灌胃。

4.Morris水迷宫测试：将大鼠从任意象限放入水迷宫系统，大鼠将在水中寻找水面下的平台，记录大鼠找到平台所需的时间，即逃避潜伏时间，每只大鼠将进行连续6天训练，3次/天，2分/次，如果2min内大鼠未找到平台，则记录其逃避潜伏时间为2min。第7天将平台撤除,将大鼠从任意水点放入水中，观察3min内的游泳轨迹，记录大鼠穿越原平台的次数，考察大鼠的学习记忆力。

5.标本制作及观察指标：Morris水迷宫实验完成后，采取10%水合氯醛腹腔麻醉并处死大鼠，以37℃ 0.9%NaCl溶液快速冲洗，立即投入4%多聚甲醛PBS溶液中灌注30min，剥离出海马组织，经4℃的4%多聚甲醛溶液固定48h，常规脱水处理，石蜡包埋，选取矢状切面切片(厚度4μm)。通过HE染色法观察比较各组大鼠海马CA1区细胞形态学变化；采用两步法进行免疫组化染色，脱蜡脱水，PBS冲洗，一抗为GSK3β(1∶150)，DAB显色，苏木精复染。在400倍显微镜下，用图像分析系统采集图像，对海马CA1区GSK3β蛋白表达阳性神经细胞单位面积和平均吸光度值进行分析。

6.采用Western blot法检测GSK3β蛋白表达:提取5只大鼠海马组织，加入裂解液中提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取50μg样本进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉进行封闭2h，按1∶1000稀释兔抗GSK3β和β-actin，4℃孵育过夜，二抗HRP标记山羊抗兔(1∶2000)孵育2h，上述过程用TBST洗涤3次，DAB显色，以目的条带与β-actin灰度值的比值作为蛋白的相对表达量。

结 果

1.大鼠Morris水迷宫实验结果比较：与假手术组比较，Aβ模型组逃避潜伏时间增加，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。与Aβ模型组比较，L-CU组和H-CU组逃避潜伏时间均增加，穿越平台次数均减少(P<0.05)。与L-CU组比较，H-CU组穿越平台次数增加，逃避潜伏时间减少(P均<0.05，表1)。

表1 4组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

2.大鼠海马HE染色结果比较：假手术组海马区神经细胞层次排列紧密，分布均匀，边界整齐，细胞核圆形，核仁清晰，胞质清亮。Aβ模型组海马神经细胞皱缩，分布散乱，间隙增大，数目明显减少，细胞核固缩并且浓染，核仁消失，胞质中出现明显空泡征。姜黄素干预组神经细胞数目减少，分布散乱，胞质量少而浓染，部分细胞核体积变小，呈椭圆形，核仁消失，详见图1。

图1 4组大鼠海马HE染色结果比较(HE，×200)

3.大鼠海马GSK3β蛋白表达阳性细胞结果比较：Aβ模型组海马区GSK3β蛋白表达阳性细胞量较假手术组明显增加。L-CU组、H-CU组与Aβ模型组比较，GSK3β蛋白阳性细胞表达均减少，且H-CU组更明显，详见图2。

图2 4组大鼠海马GSK3β蛋白表达阳性细胞结果比较(IHC，×400)

4.大鼠GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积、平均吸光度值结果比较：与假手术组比较，Aβ模型组GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积、平均吸光度值增加(P<0.01)；L-CU组、H-CU组与Aβ模型组比较，GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积、平均吸光度值减少(P<0.01)；与L-CU组比较，H-CU组GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积、平均吸光度值减少(P<0.01，表2)。

表2 4组大鼠GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积、平均吸光度值结果比较

5.大鼠Western blot法检测GSK3β蛋白表达结果比较：Aβ模型组与假手术组比较，GSK3β蛋白表达增强；L-CU组、H-CU组与Aβ模型组比较，GSK3β蛋白表达均有减弱，详见图3。

图3 4组大鼠Western blot法检测GSK3β蛋白表达结果比较

讨 论

至今对AD的发病原因及机制均尚未完全阐明，脑大体病理呈现出弥漫性脑萎缩，镜下病理改变包括tau蛋白异常磷酸化形成神经元纤维缠结(NFTs)，广泛神经元损伤缺失、Aβ沉积形成老年斑(SPs)、轴突及突触功能障碍。中药单体姜黄素具有抑制炎性细胞因子、抗氧化、抗细胞凋亡等复合特性，因为其药理作用广泛、分子靶点众多、毒性不良反应小、安全性良好，已用于多种疾病的预防与治疗[4]。近期研究发现，姜黄素能改善认知功能，减少细胞凋亡，起到神经保护作用，有望为AD等神经退行性疾病的治疗提供新思路[5～7]。

正常情况下，淀粉样前驱蛋白(amyloid precursor protein，APP)经过β-分泌酶作用，产生C-末端片段(CTF-99)，γ-分泌酶裂解该片段，产生β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)，Aβ可以通过自噬降解、血-脑脊液屏障转运等途径清除，当大量Aβ生成，超过自身清除能力或降解功能受损时，就会导致Aβ聚集，产生细胞毒性作用。研究显示，过量沉积的Aβ会导致线粒体功能障碍,引起突触丢失、神经元紊乱，推动了AD病程发展[8,9]。另一方面，Aβ可以通过多种途径介导神经细胞氧化应激，从而导致细胞损伤、凋亡或坏死[10]。本实验也证明了上述观点，大鼠在注射Aβ溶液后出现空间记忆和学习能力减退。姜黄素干预组与模型组比较，逃避潜伏时间均减少、跨越平台次数均增多，H-CU组要优于L-CU组，且姜黄素的剂量与改善认知、缓解AD发展的作用呈正相关。

海马是大脑中与认知、记忆等功能密切相关的重要区域之一，正常情况下，神经元不断产生替换凋亡或坏死的神经元，而AD患者海马萎缩及海马区神经元细胞生成能力下降，细胞信号传递紊乱，导致认知功能障碍、学习记忆能力下降[11]。本研究中HE染色结果证实，过量Aβ可致神经细胞元数目减少，细胞损伤，而注射不同浓度姜黄素后神经细胞形态较模型组明显改善，提示姜黄素可呈浓度依赖性减轻海马区神经细胞损伤，猜测可能是与姜黄素具有增强SOD活性、抑制炎性细胞因子的作用相关。

研究证实，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路能调控信号转导及细胞分化、生长、凋亡等过程[12,13]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)在海马区高度表达，是PI3K/Akt信号通路的核心部分。Gandy等[14]研究发现，在AD模型小鼠脑组织的NFTs中可以检测出较高表达的GSK3β蛋白。Ly等[15]研究表明，抑制GSK3β蛋白的活性可以降低APP水解途径，减少Aβ的形成，清除异常积聚的Aβ。有研究证实姜黄素同时参与Aβ沉积过程及tau蛋白过度磷酸化，通过抑制GSK3β蛋白活性，可以阻断PI3K/Akt/GSK3信号通路，起到缓解神经细胞损伤，减缓AD发展的作用[16]。因而寻求能有效抑制GSK3β过度表达的药物成为研发AD治疗的新思路，本实验结果显示，模型组大鼠海马区GSK3β高表达，而姜黄素干预后，GSK3β蛋白表达阳性细胞的阳性单位面积减少、平均吸光度值降低，说明姜黄素可能是通过抑制了GSK3β蛋白的表达，从而调节Aβ诱导的细胞损伤的作用，而GSK3β是PI3K/Akt信号转导通路下游的关键蛋白，姜黄素改善认知的作用可能与该信号通路相关。

综上所述，姜黄素可能通过PI3K/Akt/GSK3介导信号转导，减少GSK3β蛋白表达，从而修复AD模型大鼠海马区损伤的神经细胞，具有改善认知功能的作用，并且这种作用与姜黄素浓度相关。