雌激素受体表达与痔疮术后水肿的相关性研究

孟凡宇 陈兴华 张磊 刘华江 俞婷 谢珉宁

(复旦大学附属金山医院中医肛肠科,上海 201508)

痔是肛垫组织，是血管增生性疾病，症状包括出血、疼痛、脱垂和肛周瘙痒，人群中患病率高达39%[1-2]。有研究[3-5]发现，痔组织中雌激素异常表达与疾病的发生发展相关。因此，我们希望通过观察痔病患者术前术后组织中ER表达情况，探讨ER与痔术后组织水肿的关系。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 2018.12月至2019.6月我科痔手术患者共185例，平均年龄(45.29±13.97)岁，男性77例，女性108例，并发术后肛缘水肿患者14例，水肿发生率7.57%，男性水肿2例(2.60%)，女性水肿12例(11.1%)，差异有统计学意义，χ2=4.658，P<0.031，年龄在31～70岁之间，平均年龄(45.29±13.97)岁。选取2018年12月至2019年6月于我科行混合痔(Miligan-Morgan术)手术切除，出现术后水肿且行水肿组织切除术的患者14例。手术均由一名有经验的医师完成。参照痔临床诊疗指南[6]。纳入标准： (1)符合混合痔临床诊断标准。(2)年龄在18周岁以上，性别不限。(3)在我科行混合痔(Miligan-Morgan)手术切除，且术后出现肛缘水肿。(4)自愿签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他肛肠科疾病患者(如肛门直肠肿瘤、溃疡性结肠炎、Crohn病、肛周皮肤病等)。(2)患有重大内科疾病。(3)近期服用各类药物，长期卧床等严重影响观察的患者。(4)妊娠及哺乳期妇女。

1.2方法 (1)临床资料采集：包括姓名、性别、年龄。共收集术后水肿患者14例，收集到11例时行IHC检测，行Western blot检测时，有6例患者因组织已全部做IHC，故无组织作为检测。其余 5例已行IHC检测的患者加上新收集3例术后水肿患者，共8例行Western blot检测。(2)免疫组化检测(IHC)：石蜡切片，脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5 min，更换二甲苯后再浸泡5 min。分别用无水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，PBS浸洗3 min×3次。抗原修复：将放有切片染色架放入盛有抗原修复缓冲液的染色盒内，放至微波炉中，加热10 min，将染色盒取出浸入流水中，自然冷却后用PBS浸洗3次。灭活酶：每张切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室温(15～25℃)封闭10 min。PBS浸洗3 min×3次。封闭:滴加1%BSA50-100ul,室温孵育20 min。甩去，不洗。抗原-抗体反应：滴加一抗50～100 uL，4℃过夜。PBS浸洗3 min×3次；一抗二抗反应：滴加羊抗兔聚合物50ul，，室温湿盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次；显色：每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液(中国 福州迈新生物科技有限公司DAB-1031)；终止显色：镜下观察染色深浅，染好立即终止,用自来水轻柔冲洗15 min用蒸馏水终止显色反应；复染：将切片放入苏木素染液(中国 南京建成公司 D005)，染色10 min ，用蒸馏水冲洗干净。如染色过深，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗后返蓝；脱水封片：分别用70%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；无水乙醇中浸泡5 min。用二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。在切片上加中性树胶(中国 国药集团化学试剂有限公司10004160)，加盖玻片；观察：光学显微镜(日本Olympus BX43)下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存(所有图片均200x拍摄)。(3)Western blot：提取痔组织的蛋白。用二辛可宁酸方法测量裂解物的蛋白质浓度。 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解物，并电泳转移到聚二氟乙烯二氟化物膜上。用5%牛血清白蛋白封闭膜，然后在4℃下与一抗(1：1 000)孵育过夜。 将膜用TBS / T洗涤3次，并在室温下与合适的第二抗体(1：2 000)一起温育1 h。 然后洗涤膜，用ECL显色免疫反应条带，并通过放射自显影观察。使用GAPDH抗体为标准化蛋白。使用G:BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

2 结 果

2.1ER的IHC结果 通过对11个痔患者术前痔组织和术后水肿组织中ER表达对比，观察到术后水肿组织中ER表达明显高于术前组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：图a和图b为病例5、6、9、10患者术前术后组织ER表达对比，图c显示术后水肿组织中ER表达高于术前组织，差异有统计学意义，t=-2.248，P<0.05。(共11例患者)图1

2.2ER的Western blot结果 通过对8个痔患者术前痔组织和术后水肿组织中ER表达对比，观察到术后水肿组织中ER表达明显高于术前组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：图a和图b为8例患者术前术后组织(10,10’分别为同一患者术前术后组织表达情况，依次类推)行western blot中ER表达情况，图c中显示术后水肿组织ER表达高于术前组织，差异有统计学意义，t=-2.872，P<0.05。图2

3 讨 论

有研究表明ER与痔的发生发展存在一定的关系[4,5]。我们研究发现女性痔水肿术后发生率高于男性，这与陈富军等[3]研究结果一致，提示雌激素表达水平可能与痔术后水肿相关。Parés D等[7]对切除的痔组织样本研究，检测女性的肛管中的雌激素和孕激素受体的表达，研究其与绝经状态和年龄的关系，被证实无显着差异，这也为我们的研究提供一定的研究基础。

因此本次研究着重从ER与痔疮术后水肿的关系出发，经对同一患者的术前组织与术后水肿组织进行IHC与Western blot的双重对比研究，发现痔疮术后水肿组织中ER表达的确较术前组织明显增高，因此我们推测ER的表达很有可能是参与痔疮术后水肿的重要影响因素。研究中出现一例特殊的患者，第8例患者术后水肿组织中雌激素表达低于术前痔组织，本例患者为一名年轻男性患者，年龄31岁，这仅仅是个例？还是由于男性中雌激素水平和女性不同而出现的结果？由于水肿男性患者仅有2例，目前还很难解释。雌激素是人体内重要的类固醇激素，可调节心血管系统、生殖系统、免疫系统、神经系统生理功能[8]，通过与雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)结合发挥作用。有研究显示雌激素存在一定的抗炎作用和促炎作用[9]。我们的研究观察到水肿痔疮中存在有ER增高表达的现象，因此我们推断雌激素参与了痔疮术后水肿的发生，并有可能是通过促进血管新生，增加了局部组织体积，从而引起了痔组织的水肿。当然以上结果还需要更大样本的检测来证实。血清中雌二醇含量、生物可利用雌二醇阈值和术后水肿是否存在一定的联系？老年男性患者中血清雌二醇水平高于绝经后女性，是否意味着老年男性术后痔水肿发生率更高？由于经费及时间所限，上述问题未能有满意的答案。有待于我们进一步研究。

总之对ER在痔组织中的表达情况的研究，为进一步研究痔术后水肿原因提供了新的思路，减少ER在局部组织中的表达也许会成为临床预防痔术后水肿的新方向。ER如何影响痔的发展及痔中血管的增生的机制仍不清楚，进一步研究痔的微观结构及血管变化，血清中雌二醇的变化也将是我们进一步研究的方向。