高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔风味物质的影响

袁先铃，彭先杰,2*，陈崇艳，万晓玉，林洪斌

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000）（2.四川丁点儿食品股份有限公司，四川成都 611732）（3.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

兔肉具有高蛋白、高消化率、高赖氨酸、高卵磷脂、低热量、低脲酸、低脂肪及低胆固醇“四高四低”的特性[1]，富含硒、磷，是维生素B的重要来源，具有抗高血压的重要功能[2]。2016年，欧洲的主要进口肉兔国家是，俄罗斯3305 t、葡萄牙3103 t、法国5272 t、德国5427 t等[3]。中国是肉兔养殖大国，占世界兔肉消费量的60%[4]。兔肉养殖主要以四川、重庆、山东、河南等地为主，占中国兔肉消费的75%。

优质的肉制品往往会因为腐败等原因导致产品的色泽、质地、营养价值等发生劣变，进而影响产品的风味及食用安全性。针对以上情况，我们往往采用机械灭菌，如高压蒸汽、巴氏灭菌和超高压等。相较于巴氏杀菌存在灭菌不彻底，超高压杀菌容易改变产品的质地及风味等现象，企业往往更多倾向于高压蒸汽杀菌。高压蒸汽杀菌具有灭菌温度低或较高、处理时间短等优点，能防止成分流失，从而有益于将产品中原有的风味及营养成分保留下来，既能达到保鲜的目的，还能起到灭菌、储藏的目的。

冷吃兔是典型地方特色美食，深受大众喜爱。为延长其保质期，使用高压蒸汽灭菌技术，这往往对冷吃兔的风味物质产生影响。因此，以冷吃兔高压蒸汽灭菌的时间为研究对象（15、20、25、30、35 min），对冷吃兔灭菌过程过程中理化成分、游离氨基酸、核苷酸及其降解产物等滋味物质和挥发性性风味物质组分进行研究，了解不同灭菌阶段风味物质的变化规律，为冷吃兔高压蒸汽灭菌工艺参数优化提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兔肉的制备：兔肉切丁、腌制、炒制、冷却、装袋、抽真空，高压蒸汽灭菌蒸气压0.1 MPa，121 ℃。兔肉、香辛料购买于宜宾市天天购超市。

5’-腺苷酸（5’-AMP）、5’-鸟苷酸（5’-GMP）、5’-肌苷酸（5’-IMP）、5’-二腺苷磷酸（5’-ADP）和次黄嘌呤（HX）5种核苷酸标准品，纯度100%，上海源叶生物科技有限公司；甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）、异亮氨酸（Ile）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）17种游离氨基酸标准品，均为分析纯，纯度 100%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；2-乙基丁酸标准品，纯度99%，罗恩试剂；NA营养琼脂，海博生物技术有限公司。

kjeltec 8400自动凯氏定氮仪，中国FOSS公司；SoxTecTM2055索式浸提仪，中国FOSS公司；1260 Infinity II高效液相色谱仪，美国Agilent公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；TRACETM 1300-TSQ 8000 Evo气相色谱-质谱联仪，美国Thermo Fisher公司；101-3AB电热鼓风干燥箱，北京中兴公司；20 mL顶空进样瓶，美国Supelco公司；Polaris5 C18-A柱（250×4.6 mm），美国Agilent公司；VD无菌操作台，河南秋佐仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 冷吃兔常温储藏中理化成分的测定

样品的水分含量测定，参考GB/T 5009.3-2016[5]中的“直接干燥法”；样品的蛋白质测定，参考 GB/T 5009.5-2016[6]中的“凯氏定氮法”；样品的脂肪测定，参考GB/T 5009.6-2016[7]。

1.2.2 冷吃兔常温储藏中滋味物质的测定

（1）氯化物的测定：所有样品的氯化物测定，均参考GB/T 5009.44-2016[8]中的“银量法”进行测定。

（2）呈味核苷酸的测定：参考Duan等[9]的方法，将10 g捣碎的冷吃兔肉在50 mL 5% HClO4匀浆30 s（10000 g/min），在 4 ℃离心 10 min（10000×g），重复一次，合并上清液，使用中速滤纸过滤。用1 mol/L和0.5 mol NaOH调节pH至6.0，过0.22 μm滤膜后待用。样品使用高效液相色谱法检测。设置参数：Polaris5 C18-A柱（250×4.6 mm），检测波长254 nm，柱温30 ℃。流动相A为0.05 mol/L K2HPO4，B为HPLC级甲醇，A:B=95:5等梯度进样，流速0.8 mL/min，进样量20 μm。

（3）游离氨基酸（FAAs）的测定：参考 GB/T 5009.124-2016[10]“食品中氨基酸的测定”：称取 0.1 g捣碎的冷吃兔肉于装有10 mL 6 mol/L盐酸的水解管中，滴3滴苯酚。充氮气，抽真空，重复3次后封口。将水解管放入电热鼓风干燥箱中110 ℃水解24 h后取出，冷却至室温。打开水解管，中速滤纸过滤，使用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中。取200 μL在干燥箱内减压干燥，加200 μL的pH 2.22柠檬酸钠缓冲溶液，过0.22 μm滤膜，使用高效液相色谱仪检测。

（4）非挥发性风味物质的测定分析：味精当量（Equivalent umami concentration（EUC），g MSG/100 g）是谷氨酸钠浓度（MSG，g/100 g），由鲜味氨基酸（Asp或Glu）和5’-核苷酸（IMP、AMP和GMP）协同表示对食品的鲜味值贡献。计算公式如下[11]：

式中：

EUC——相当于谷氨酸钠，g MSG/100 g；

1218——g/100 g协同系数；

αi——Asp、Glu 的浓度，g/100 g；

βi——Asp、Glu相当于 MSG 的相对鲜度系数（Asp为0.077；Glu为1）；

αj——5′-GMP、5′-AMP、5′-IMP 的浓度，g/100 g；

βj——5′-GMP、5′-AMP、5′-IMP 相对于 5′-IMP 的相对鲜度系数（5′-AMP 为 0.18；5′-IMP 为1；5′-GMP 为 2.3）。

滋味活性值（TAV）是通过计算冷吃兔中呈味物质且贡献显著的计算值的。即TAV值＞1，该物质对呈味有贡献；TAV值＜1，该物质对呈味几乎没有贡献，由此确定呈味物质[12]。

1.2.3 挥发性风味物质的检测

（1）顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME/GCMS）检测：参考Guo等[13]的方法：将4 g冷吃兔捣碎放入20 mL顶空进样瓶，老化后的顶空固相萃取头插入进样瓶，50 ℃平衡30 min后置于进样口200 ℃解析5 min。色谱条件：进样口温度200 ℃，不分流进样，色谱柱为DP-WAX，载气流速1 mL/min，柱温箱初始温度为40 ℃，最终温度为200 ℃。质谱条件：离子源温度为280 ℃，传输线温度为260 ℃，扫描范围 30～550m/z。

定性分析：在普库（NIST11、NIST11s）对化合物的质谱进行鉴定，记录匹配度大于等于 80的化合物。定量分析：在顶空固相微萃取前加入 40 µL 0.2µg/mL 2-乙基丁酸作为内标，采用面积归一化法计算各化合物的相对浓度。

（2）气味活性值（OAV）的计算分析：气味活性值能表述风味化合物的贡献大小。通过将测定的浓度除以它们各自的气味阈值来计算关键气味的OAV[14]。公式如下：

式中：

Ci——风味物质i的质量浓度，µg/kg；

Ti——该风味物质i的嗅觉阈值，µg/kg。

当0≤OAV＜1，说明该风味物质对总体风味无实际作用，对炭烤羊腿风味具有一定的修饰作用；OAV≥1，说明该风味物质可能对总体风味有直接影响，被确定为炭烤羊腿中特征风味物质；OAV值越大说明该组分对总体风味贡献越大。

1.3 统计分析

实验结果通过Excel 2013对数据进行统计分析，将各个指标用SPSS进行方差分析（ANOVA），用多重比较法分析差异显著性，其中p＜0.05表示差异显著[15]。使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔理化成分的影响

食品中的水分含量能有效影响食品的性质，并且与蛋白质、脂肪等非水组分通过结合的方式相互作用[16]。蛋白质能影响肉制品硬度，并能降解形成多肽及硫氨基酸影响风味物质的产生[17]。脂肪在贮藏中发生氧化及水解等反应，能产生醛类、酮类等风味物质。pH能影响美拉德反应中半胱氨酸与还原糖反应风味物质的进行[18]，且对微生物的生长环境也具有一定的影响。

冷吃兔在高压蒸汽灭菌过程中的水分、蛋白质、脂肪及pH含量如图1所示。随着灭菌时间的延长，水分含量在其过程中无明显变化（p＞0.05），在20 min时含量较高，达22.87%。蛋白质含量在25 min时较高达到28.53%，在35 min较低为27.18%。脂质一直呈降低趋势，在20～30 min显著降低（p＜0.05）。pH则与脂质相反，在15～25 min时，显著增加，之后无明显变化。总体而言，高压蒸汽灭菌的时间对冷吃兔的水分、蛋白质、脂质及pH无明显影响。与未进行灭菌的冷吃兔进行比较，在15～20 min的理化指标最为相似。

2.2 高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔滋味物质的影响

2.2.1 高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔氯化物的影响

表1 高压蒸汽灭菌中冷吃兔的氯化物含量及TAVTable 1 Chloride content and TAV in rabbits fed cold in autoclave sterilization

氯化钠在食品中起着提供咸味的作用，除了有改善风味的特性，还能与其他滋味物质协同作用，且可以抑制微生物的生长。由表1可知，在高压蒸汽灭菌的过程中，氯化物浓度无明显的变化（p＞0.05）在25 min时，氯化物含量相对较高，为0.98 g/100 g。结合阈值0.036 g/100 g可知，其灭菌过程中，TAV均＞1，咸味的呈味效果依旧显著。与为灭菌的冷吃兔比较，灭菌20 min时的TAV与其最为相似。

游离氨基酸是挥发性风味物质的主要前体物质，是对食品中呈味影响较大的物质，能直接或间接影响到食品的风味。章银良等[19]指出不同的时间、温度、盐浓度及金属离子都能在一定程度上影响游离氨基酸的含量。棘怀飞等[20]证明随着美拉德加热时间的增加能使呈味氨基酸的总量增加，鲜味和甜味氨基酸的比例降低，苦味氨基酸增加。

表2 高压蒸汽灭菌中冷吃兔的游离氨基酸含量Table 2 Content of free amino acids in rabbits fed cold in autoclave sterilization

表3 高压蒸汽灭菌中冷吃兔的呈味核苷酸含量Table 3 The content of flavorful nucleotide in cold-eating rabbits in autoclave sterilization

由表2可知，总游离氨基酸的含量在15～20 min明显降低，后显著增加（p＜0.05），在20 min时的含量最低为706.75 mg/100 g，在35 min时的含量最高为764.07 mg/100 g。鲜味氨基酸随灭菌时间的延长，其含量在15～30 min呈波浪式变化，35 min时含量达到最高值，含量增加到353.59 mg/100 g。Glu是冷吃兔的主要呈鲜味游离氨基酸，在灭菌过程中由 15 min时的 294.34 mg/100 g增加至 35 min时的 305.03 mg/100 g，较Asp的变化大。

呈甜味氨基酸中，总含量在15～20 min时显著降低，在25～35 min显著增加（p＜0.05）。其中Lys的含量在呈甜味氨基酸中最高，结合阈值，TAV在灭菌过程中均＞1，是冷吃兔灭菌后的主要呈甜味游离氨基酸，且含量变化趋势与SFAA的变化趋势相一致。呈苦味氨基酸的含量先呈降低趋势，在 25 min显著增加，之后再明显降低（p＜0.05），Leu与His的含量相对较高，结合相应阈值，His的TAV均＞1，是冷吃兔灭菌后的主要呈苦味氨基酸。

不同呈味核苷酸的呈鲜味效果不同，其对肉品鲜味的贡献度主要取决于呈味强度值。研究发现，具有鲜味特征的核苷酸及其衍生物为 30多种芳香杂环化合物，以 5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸和 5’-腺苷酸三种为代表，当核糖中出现5’位碳原子上具有磷酸基团、嘌呤中6’位碳原子上具有一个羟基或鲜味核苷酸均为嘌呤类时，核苷酸具有呈鲜味的特性[21]。

核苷酸中的5’-GMP与5’-IMP是鲜味的主要贡献者，除了本身的贡献外，还能与氯化物或者游离氨基酸等协同作用。由表 3可知，鲜味核苷酸中，5’-GMP在30 min时有最大值2.57 mg/100 g，结合阈值12.5 mg/100 g，TAV均＜1。在灭菌过程中，损失较为严重，且对冷吃兔的滋味无作用或作用效果不明显。5’-IMP是冷吃兔的特征滋味物质，在35 min时具有最大值，与未灭菌时相比，含量增加了 1.80 mg/100 g，即高压蒸汽灭菌在35 min使更有益于鲜味的呈现。5’-AMP是呈甜味氨基酸，在25 min时具有较大值。5’-ADP与HX在35 min时的含量较大。

2.2.3 高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔的味精当量影响

味精当量（EUC）是衡量食品整体鲜味呈现度的重要指标。根据计算，冷吃兔在高压蒸汽灭菌时的EUC如图2所示，35 min的EUC最高，为18.68 g MSG/100 g，显著高于 15～30 min（分别为 16.75、16.57、15.71、17.21 g MSG/100 g），这是由于灭菌35 min时Asp与Glu的高含量导致。结合MSG的滋味阈值（0.03 g/100 g）得出，冷吃兔高压蒸汽灭菌15～35 min得到的EUC值均大于MSG的滋味阈值，及在灭菌对冷吃兔的鲜味无明显的影响，且在35 min时的鲜味更强于未灭菌前的产品。

其中，E(X2)<∞且E(Y2)<∞。我们用var(E(Y|X))/var(Y)表示给定X条件下Y的解释方差，即有

2.3 高压蒸汽灭菌时间对冷吃兔风味物质的影响

如图3可知，通过HS-SPME/GC-MS对常温储藏期的冷吃兔的风味进行检测。灭菌过程中检测出 10大类54种化合物，其中在15 min时检测出挥发性风味物质45种，20 min检测出43种，25 min检测出45种，30 min检测出50种，35 min检测出40种。15～35 min的灭菌时间中，在30 min时检测到的风味物质种类最多，35 min时的风味物质总含量最高。

表4 高压蒸汽灭菌过程中的特征风味物质分析Table 4 Analysis of characteristic flavor substances in the process of autoclave sterilization

醛类化合物是脂肪的氧化降解及酶或微生物的氧化所形成[22]，检测出有6种，15～35 min分别检测出5、5、6、6、4种。其中十六醛的含量最好，在15～25 min显著上升（p＜0.05），之后显著降低，十六醛能赋予冷吃兔好的果香味。其次为(E,E)-2,4-癸二烯醛，是油炸食品中的主要挥发性风味物质，带有脂肪味和烤肉味。检测出酮类2种，主要是由氨基酸降解、脂肪氧化及美拉德反应产生。醇类主要由肌肉中的共轭亚油酸被脂肪氧合酶和氢过氧化酶降解产生[23]，检测出有9种，其中芳樟醇的含量最高，是冷吃兔的特征风味物质，是香油中的主要挥发性成分。酸类化合物是一般脂肪氧化降解为低级脂肪酸产生[24]。萜类可能是由原材料所提供，如姜烯是姜粉中为主要挥发性风味物质[25]。检测出烃类5种、酯类4种、酸类10种、醚类2种、酚类2种、萜类4种及其他10种。

冷吃兔经过高压蒸汽灭菌15～35 min所得的特征风味物质的OAV如表4所示。与未灭菌的冷吃兔特征风味物质相比，特征挥发性风味物质种类和 OAV值均存在差异。未灭菌中检测到特征风味物质为 9种，而灭菌15 min时，特征风味物质减少到7种，20～35 min均检测出6种，是因为(-)-4-萜品醇随着灭菌时间的延长，其OAV＜1，对冷吃兔无明显的作用或甚至无作用。

由表4可以看出，除(E,E)-2,4-癸二烯醛与十六醛随灭菌时间的延长，OAV在相应增加外，其余都在不断降低，且均小于未灭菌时的 OAV。相对于未灭菌的冷吃兔，灭菌之后降低了柠檬醛具有的柠檬风味，苄醇具有的香脂味，甚至(-)-4-萜品醇所具有的香料味也将一定程度的降低。因此，从特征挥发性风气味物质再现程度分析，灭菌15～20 min是对特征风味物质的保留的较好时间。

3 结论

3.1 随着灭菌时间的延长，水分含量、蛋白质、脂质、pH无明显影响。与未进行灭菌的冷吃兔进行比较，在15～20 min的理化指标最为相似。

3.2 氯化物的呈咸味效果显著，与未灭菌的冷吃兔比较，灭菌20 min时的TAV与其最为相似。总游离氨基酸含量先降低后增加。鲜味氨基酸的含量35 min达最大值。Glu是冷吃兔的主要呈鲜味游离氨基酸；Lys是主要的呈甜味游离氨基酸；His是主要的呈苦味氨基酸。呈味核苷酸中，5’-IMP的 TAV＞1，是冷吃兔的呈鲜味物质，与未灭菌时相比，含量增加了1.80 mg/100 g。计算EUC，35 min的EUC最高，为18.68 g MSG/100 g。结合 MSG的滋味阈值（0.03 g/100 g）得出，冷吃兔高压蒸汽灭菌15～35 min得到的EUC值均大于MSG的滋味阈值，具有很好的鲜味呈现效果，且在 35 min时的鲜味更强于未灭菌前的产品。

3.3 从灭菌过程中共检测出10大类54种化合物，其中醛类有6种，酮类2种，醇类9种，烃类5种，酯类4种，酸类10种，醚类2种，酚类2种，萜类4种及其他 10种。与未灭菌的冷吃兔特征风味物质相比，特征挥发性风味物质种类和 OAV值均存在差异。未灭菌中检测到特征风味物质为9种，而灭菌15 min时，特征风味物质减少到7种，20～35 min均检测出6种。除(E,E)-2,4-癸二烯醛与十六醛随灭菌时间的延长，OAV在相应增加外，其余都在不断降低。因此，从特征挥发性风气味物质再现程度分析，灭菌15～20 min是对特征风味物质的保留的较好时间。

3.4 综上所述，冷吃兔在灭菌20 min时，所呈现的咸味及特征性风味物质效果最好，鲜味呈现效果较好。